姜黃素可緩解多囊卵巢綜合征大鼠卵巢炎癥狀態并改善其功能

張韻函，謝盛言，何珊珊

(遵義醫科大學附屬第三醫院，遵義市第一人民醫院 婦產科，遵義 563000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種常見的內分泌疾病，患者可出現多種代謝紊亂癥狀，如胰島素抵抗、胰島β細胞功能障礙、葡萄糖不耐受、血脂異常和肥胖等[1-2]。患者內分泌激素如卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)、雌二醇(estradiol，E2)、黃體生成素(luteinizing hormone，LH)、孕酮(progesterone，P)、睪酮(testosterone，T)的分泌紊亂，可能與受精率降低及胚胎發育異常有關[3]。許多研究證實，在PCOS患者中，CRP與胰島素抵抗、體質量和脂肪含量呈正相關。此外，IL-6在卵巢成熟和胚胎著床過程中發揮重要作用[4]。TNF-α是一種能夠刺激卵泡膜細胞增殖的炎性因子，在卵泡和黃體期對卵巢的正常活動起重要調節作用，可在巨噬細胞、卵母細胞、顆粒細胞、閉鎖卵巢和卵泡膜細胞中檢測到其基因表達[5]。

姜黃是一種生長在東南亞熱帶地區的植物，姜黃素是一種提取自姜黃根莖的黃色多酚類化合物[6]。近期的研究結果表明，姜黃素具有強大的抗炎活性，能夠降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子水平，在多種炎癥相關性疾病中均有良好效果[7]。鑒于以上因素，研究比較姜黃素對PCOS大鼠模型血清性激素(E2、LH、FSH、P、T)及組織中TNF-α、IL-6和CRP水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物隨機取70只3周齡雌性SD大鼠，于SPF條件下給予12 h/12 h晝夜交替環境。室溫控制在(25±1) ℃，于實驗前1周對大鼠進行適應性飼養，每天定時供應食物和水。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模及樣本的制備 將70只雌性SD大鼠隨機分為正常組(N組)(10只)及PCOS造模組(60只)。模型組于皮下注射60 mg/kg的5%脫氫表雄酮，連續注射20 d。第21天起自模型組和正常組中各隨機抽取5只大鼠行陰道涂片，觀察動情周期變化，連續觀察3個動情周期(約15 d)，于造模以及藥物干預期間每日用電子天平稱量大鼠體質量。于第15天自大鼠球后靜脈叢取血、離心、分離血清，采用放射免疫法檢測血清性激素水平及空腹血清胰島素(fasting serum insulin，FINS)。顯微鏡下觀察并判斷動情狀態：動情前期的涂片出現有核上皮細胞，偶有少量角化細胞；動情期涂片則顯示無核角化細胞或偶有少量上皮細胞；動情后期出現有核上皮細胞、無核上皮細胞和白細胞；動情間期的涂片中存在大量白細胞，當大鼠陰道涂片連續出現角化細胞、動情周期和性激素水平紊亂及FINS水平升高提示造模成功。隨后將造模組大鼠根據動情周期結果分為4組， 即PCOS模型組(PCOS組)、藥物治療高劑量組(A組)、中劑量組(B組)及低劑量組(C組)，隨后進行為期一個月的腹腔姜黃素注射治療(高劑量組100 mg/ kg、中劑量組75mg/ kg、低劑量組50 mg/ kg)，正常組和對照組均注射等量生理鹽水。姜黃素連續治療30 d后，麻醉各組大鼠并自腹主動脈處采血，離心取上清液備用；處死大鼠取雙側卵巢，剝除多余脂肪組織并用電子天平稱重，計算卵巢指數[大鼠卵巢指數=(大鼠卵巢濕重/大鼠體質量)× 100%]；取一側大鼠卵巢石蠟包埋以行免疫組化檢測，另一側用錫紙包埋后迅速放入液氮中保存。

1.2.2 ELISA檢測各組大鼠血清性激素水平 按照ELISA檢測試劑盒說明書測定大鼠血清中性激素水平(E2、LH、FSH、P、T)，于酶標儀測定光密度D(450 nm)。

1.2.3 免疫組織化學法染色 切片脫蠟，抗原修復后加入稀釋好的抗TNF-α、IL-6抗體(稀釋度為TNF-α 1∶100，IL-6 1∶200)，加入適量生物素標記的二抗工作液，顯色劑顯色，流水充分漂洗，復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下染色結果示卵巢組織樣本中細胞胞質呈淡黃色或黃色顆粒狀著色，采用IPP 6.0軟件于相同條件下檢測每張組織切片中TNF-α、IL-6表達的積分光密度(integrated optical density， IOD)。

1.2.4 ELISA檢測各組大鼠血清CRP、IL-6、TNF-α水平 按照ELISA檢測試劑盒說明書測定大鼠血清中CRP、IL-6、TNF-α水平，于酶標儀測定光密度[D(450 nm)]值。

1.2.5 血糖檢測儀檢測各組大鼠血清空腹血糖(fasting blood glucose， FBG)、FINS和穩態模型胰島素抵抗指數(homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR)水平 用血糖檢測儀檢測各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平。

2 結果

2.1 大鼠動情周期的測量與N組相比，PCOS組大鼠動情周期不規律且出現紊亂，其中動情前期、動情期持續時間差異無統計學意義(P>0.05)，但動情間期及后期顯著延長 (P<0.05)，經過藥物治療動情周期紊亂及延長的情況得到有效改善。詳見表1。

表1 各組大鼠動情周期變化情況

2.2 各組大鼠血清E2、LH、FSH、P、T水平及卵巢指數和大鼠體質量的檢測結果顯示，PCOS組與N組比較，大鼠血清FSH、P水平顯著降低(P<0.05)，E2、LH、T水平顯著升高，大鼠體質量和卵巢指數也顯著升高(P<0.05)；藥物處理后，各治療組與PCOS組比較，血清FSH、P水平顯著升高，E2、LH、T水平顯著降低，大鼠體質量和卵巢指數也顯著降低(均P<0.05，表2、表3)。

表2 各組大鼠血清性激素水平比較

表3 各組大鼠卵巢指數及體質量比較

2.3 各組大鼠血清FBG、FINS和HOMA-IR水平的檢測PCOS組大鼠血清中FBG、FINS及HOMA-IR水平較N組顯著升高(P<0.05)；各藥物治療組大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR水平與PCOS組相比下降，其中高、中劑量治療組水平下降顯著(P<0.05，表4)。

表4 各組大鼠血清FBG、FINS及HOMA-IR水平比較

2.4 各組大鼠血清CRP、IL-6和TNF-α水平的檢測與N組相比，PCOS組血清CRP、IL-6和TNF-α水平顯著升高，藥物干預后各治療組血清CRP、IL-6、TNF-α與PCOS組相比均下降，其中高、中劑量治療組下降顯著(均P<0.05，表5)。

表5 各組大鼠血清CRP、IL-6和TNF-α水平比較

2.5 TNF-α在卵巢組織中的表達結果顯示，TNF-α蛋白在卵巢顆粒細胞、卵母細胞及顆粒黃體細胞中表達。與PCOS組相比，N組和藥物干預組TNF-α在卵泡顆粒層的表達很少且在卵泡膜中不表達，但在卵泡液中有明顯的沉淀(棕色)。與PCOS組相比，藥物治療組卵巢、卵巢顆粒細胞和卵母細胞周圍TNF-α表達減少，其中高劑量藥物治療組效果最佳(P<0.05)，卵巢中TNF-α表達量顯著下降。詳見圖1、表6。

注：A.N組；B.POCS組；C.A組；D.B組；E.C組。圖1 免疫組織化學染色分析各組大鼠卵巢組織中TNF-α的表達(×200)

表6 各組大鼠卵巢組織中TNF-α表達水平的比較

2.6 IL-6在卵巢組織中的表達結果顯示，與N組比較，PCOS組卵巢間質、腔前卵泡和顆粒層中IL-6表達顯著增加(P<0.05)；藥物治療后各組間質細胞、卵泡膜、顆粒卵泡中IL-6的表達較PCOS模型組顯著降低(P<0.01)，其中高劑量藥物治療組作用最佳，卵巢中IL-6表達量顯著下降(P<0.05)。詳見圖2、表7。

表7 各組大鼠卵巢組織中IL-6表達水平的比較

注：A.N組；B.POCS組；C.A組；D.B組；E.C組。圖2 免疫組織化學染色分析各組大鼠卵巢組織中IL-6的表達(×200)

3 討論

PCOS患者治療的總體目標是幫助婦女正常排卵，降低雄激素水平、體質量及糖尿病和心血管疾病風險[8]。一般來說，大多數PCOS患者卵巢內有多個小卵泡，這些卵泡通常對促性腺激素敏感。Van H等[9]的研究提示PCOS患者卵巢和內臟脂肪厚度增加。本研究PCOS模型組大鼠體質量增加，動情周期出現紊亂及延長現象，卵巢指數上升，說明建模成功。Smith等[10]的研究提示PCOS患者卵泡顆粒細胞可能存在異常，內臟脂肪量的增加導致血清TNF-α水平上升。Eleni等[11]報道稱PCOS患者血清TNF-α水平升高，可能是IL-6刺激單核細胞產生的，為探討IL-6、高雄激素血癥與人體代謝改變的關系，進一步了解PCOS相關內分泌代謝異常的意義，本研究測定了PCOS大鼠性激素水平、代謝相關指標及慢性炎癥指標IL-6、TNF-α和CRP的水平。

黃紅藝等[12]研究表明，CRP水平升高與胰島素抵抗有關，增加了2型糖尿病及心血管疾病的發病風險。Ramezani等[13]的研究表明，PCOS患者血清中CRP水平升高，提示患者體內存在慢性炎癥，他們還發現PCOS患者CRP水平升高與肥胖有關。Cabus U等[14]2020年的研究結果顯示，CRP水平的降低與接受二甲雙胍治療的PCOS患者代謝癥狀的減輕是一致的。姜黃素的治療與降低CRP水平有關，這些發現符合姜黃素對該綜合征的治療作用。有研究表明，PCOS患者血清炎性因子(IL-6和IL-18)水平顯著升高，與胰島素敏感性參數呈正相關；姜黃素調節機體代謝以及內分泌功能，有助于改善PCOS癥狀[15]。體外研究表明，炎性因子能夠上調卵巢卵泡膜細胞中的類固醇生成酶水平，炎性因子也能刺激卵泡膜細胞的增殖。此外，異常的炎癥反應可能會損害排卵過程的精細調節。2009年，Maryam T等[16-17]研究顯示姜黃素處理對卵巢癌細胞起到抗增殖、促凋亡和激素分泌抑制等作用。這些作用不僅在小鼠在體與離體卵巢細胞中可觀察到，也可在人卵巢細胞中觀察到。脂肪組織源性細胞因子(TNF-α、IL-6)的表達可能是維持慢性炎癥的重要因素，內臟脂肪組織的堆積可能是支持代謝綜合征和慢性炎癥反應的關鍵因素。Hu X等[18]的研究結果提示，姜黃素抑制卵巢癌細胞增殖，誘導細胞凋亡，減少激素的產生和釋放，因此，他們建議將姜黃素作為新的治療方法。Wang C等[19]發現姜黃素可能通過抑制胰蛋白酶的活性和NF-κB信號通路中細胞的凋亡以減少卵巢組織損傷。本研究發現，姜黃素治療能降低卵巢指數減少原始卵泡和黃體數量，并在治療后改善動情周期及性激素水平的紊亂，調節血糖，降低炎性因子在血清及組織中的表達，可能成為臨床治療PCOS的一種新方法。