響應面法優化玫瑰紅豆復合米酒發酵工藝

彭春芳，袁松林，劉琨毅，陸 兵，李秀萍，陳 卓

（1.宜賓職業技術學院 五糧液技術與食品工程學院，四川 宜賓 644003；2.宜賓市金喜來酒業有限公司，四川 宜賓 644104）

玫瑰（Rosa rugosa）為薔藻科灌木植物，花色艷麗，花香芬芳濃郁，花瓣中含有花青素、多酚、抗氧化劑、維生素等多種營養元素[1]。玫瑰花具有抗氧化、調節內分泌、行氣活血、改善脾胃、解郁安神等功效[2-4]。經常食用含玫瑰花的食品可以增強體質、改善膚質，因此深受廣大女性青睞。

赤小豆（Vigna umbellata）是豆科一年生草本植物[5]，其成熟的種子顏色暗紅，民間俗稱為紅豆。其富含黃酮、酚類化合物、蛋白質、超氧化物歧化酶等多種活性成分[6-8]。紅豆是藥食同源食物，具有清熱解毒、行血補血、利水消腫、健脾去濕等功效[5，8]，常用于制作各種食品。

米酒又稱甜酒釀，是我國傳統發酵型飲品，以糯米為主要原料，蒸煮糊化后加入酒曲經特殊發酵工藝釀制而成[8]。米酒酸甜可口、醇香誘人，酒精度低，可以直接飲用，也可用于制作各種小吃美食，深受消費者歡迎。此外米酒還具有極高的營養價值和保健功能[9]。在民間，甜米酒早已成為開胃健脾、產婦催奶的絕好佳品。

目前，米酒產品開發主要集中在添加某一種谷物、花卉、水果或保健食材，而用多種食材加工復合米酒的研究比較少[10-11]。玫瑰和紅豆的組合在食品加工中運用廣泛，但將二者結合在米酒制作中尚缺乏研究。該試驗以食用玫瑰、紅豆及糯米為原料，采用單因素試驗考察不同因素對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響，再利用響應面試驗設計優化發酵工藝，研制出一款清新雅致，獨具特色的復合米酒，為復合米酒開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食用玫瑰（干花）、紅豆（赤小豆）、糯米：市售；安琪甜酒曲：安琪酵母股份有限公司；氫氧化鈉、硫酸銅、次甲基藍指示劑、苯酚、氯化鉀（均為分析純）：成都市金山化學試劑有限公司；鹽酸、硫酸（均為分析純）：天津市化工三廠有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

FA1004型電子分析天平：上海上平精密儀器有限公司；LDZX-30KBS型高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械有限公司；BJPX-400型恒溫培養箱：卓絕醫療器械有限公司；JS39D-250型榨汁機：浙江紹興蘇泊爾生活電器有限公司；C21-RT2120型電磁爐：美的生活電器有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋：上海力辰西儀器有限公司；PHSJ-4A型pH計：上海雷磁儀器有限公司；LMN5D-5L發酵罐：駱易家玻璃制品廠；1 000 mL真空抽濾裝置：上海暉創化學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰紅豆復合米酒加工工藝流程及操作要點

操作要點：

糯米和紅豆的浸泡：選取優質糯米，置于無油污容器中，清洗2～3次，料水比1∶2（g∶mL），室溫浸泡12 h。浸泡后的糯米用手指一捻即碎，若米粒不捻已碎則說明浸泡時間過長，相反若有白心則說明浸泡時間不夠[12]。選取色澤暗紅且有光澤的優質紅豆，洗凈后按料水比1∶2（g∶mL）室溫浸泡14～16 h[13-14]。

玫瑰花的處理[15]：選擇當年產制的顏色鮮亮、香氣芬芳濃郁的干花蕾，冷水沖洗后用200 mL沸水沖泡，保溫30 min，打漿備用。

蒸飯：將浸泡后的糯米和紅豆混合均勻，用蒸鍋常壓蒸米30 min，要求米粒膨脹糊化，內無白心，松散柔軟，但不粘黏成團[12]。

淋冷：將蒸煮好的糯米和紅豆用1 L無菌蒸餾水淋冷至30 ℃左右。

混合、拌曲、搭窩：按照料液比1∶1（g∶mL）加入無菌蒸餾水，加入玫瑰花漿、甜酒曲，充分混勻，裝入5 L發酵罐，中間挖一個倒喇叭形圓窩，用保鮮膜封口[12]。

發酵：將發酵罐置于30 ℃恒溫培養箱發酵，直至中間圓窩中流出酒液并漸漸沒過原料。

過濾、滅菌：醪液用雙層無菌尼龍布過濾，分裝至180mL無菌玻璃瓶，巴氏滅菌（65 ℃、30 min）[15]，冷卻后即為玫瑰紅豆復合米酒成品。

1.3.2 玫瑰紅豆復合米酒發酵工藝優化

（1）單因素試驗

按照1.3.1的操作流程和要點，以還原糖含量、總酸含量、酒精度及感官評分為評價指標，在糯米質量為2 kg、玫瑰花添加量為糯米質量的1.0%、紅豆添加量為5.0%、酒曲添加量0.3%及30 ℃發酵48 h的基礎條件下，每次只改變4個因素中的1個因素，保持其他因素不變，分別考察酒曲添加量（0.1%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%）、發酵時間（24 h、36 h、48 h、60 h、72 h）、玫瑰花添加量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%）、紅豆添加量（5.0%、10.0%、15.0%、20.0%、30.0%）對復合米酒品質的影響。

（2）響應面試驗

在單因素試驗結果的基礎上，依據Box-Behnken中心組合試驗原理設計各因素和水平[15-17]。以酒曲添加量（A），發酵時間（B），玫瑰花添加量（C）及紅豆添加量（D）為影響因素，玫瑰紅豆復合米酒感官評分（Y）為響應值，利用響應面法優化發酵工藝。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.3 分析檢測

酒精度測定：按照國標GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》[18]；還原糖測定：按照國標GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》[19]；總酸測定：按照國標GB 12456—2008《食品中總酸的測定》[20]；大腸桿菌數測定：按照國標GB/T 4789.3—2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》[21]；菌落總數測定：按照國標GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》[22]。

感官評價：由10名三級品酒師組成的評定小組從外觀、香氣、滋味、風格等4個方面進行感官綜合評定，滿分100分。參考農業行業標準NY/T 1885—2010《綠色食品米酒》[23]建立玫瑰紅豆復合米酒感官評分標準見表2。

表2 玫瑰紅豆復合米酒感官評分標準Table 2 Sensory evaluation standards of rose and red bean compound rice wine

2 結果與分析

2.1 玫瑰紅豆復合米酒發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 酒曲添加量對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響

由圖1可知，隨著酒曲添加量的增多，酒液還原糖先上升，在酒曲添加量為0.6%后趨于平緩，說明酒曲添加0.6%就足以使淀粉轉化完全。酒曲添加量＞0.6%之后，酒精度和總酸升高，說明酒曲中的根霉菌將原料中的淀粉轉化為可發酵性糖，給酵母菌提供了能量來源，大量的根霉消耗環境中的氧氣，為酵母菌的生長提供了條件[4，24]。感官評定結果顯示，隨著酒曲添加量增多，感官評分先升高后降低，可能是由于隨著酒曲量增大，發酵速度加快，乙醇、有機酸等風味物質增多，酒體風味飽滿；但酒曲量過多時，酒體酸甜比例失調，苦味突出[11，25]。酒曲添加量為0.6%時，米酒醇香濃郁，酸甜比例恰當，感官評分最高，為83.5分。因此，選擇最適酒曲添加量為0.6%。

圖1 酒曲添加量對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響Fig.1 Effect of Jiuqu addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.2 發酵時間對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響

由圖2可知，當發酵時間為24～48 h，酒曲中的根霉菌產生大量的淀粉酶和糖化酶，將糊化后的淀粉轉化為可發酵性糖[25-28]；還原糖含量持續升高，酵母菌快速繁殖，酒精度和總酸含量隨之增多[27-29]，感官評分升高。發酵時間＞48 h之后，還原糖含量下降，酵母菌等有益微生物利用還原糖產生乙醇、有機酸等酒體風味物質；在發酵時間為60 h時，酒體酒精度達到3.45% vol，感官評分最高，為88.9分。在發酵時間為72 h時，酒精度持續升高，酒味刺鼻，玫瑰花和紅豆的風味被掩蓋，且酸度增高，酸甜失調。因此，選擇最適發酵時間為60 h。

圖2 發酵時間對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.3 玫瑰花添加量對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響由圖3可知，隨著玫瑰花添加量的增多，米酒的還原糖含量、總酸含量和酒精度并未發生明顯變化。而感官評分結果顯示，隨著玫瑰花添加量的增多，復合米酒感官評分先升高后降低，在玫瑰花添加量為2.0%時，感官評分最高，為82.3分。原因可能是：玫瑰花過少時，米酒中花香不明顯，顏色偏淡；玫瑰花過多時，米酒花香太重，掩蓋了米酒的酒香和紅豆的甜香，口感略帶苦澀。因此，選擇最適玫瑰花添加量為2.0%。

圖3 玫瑰花添加量對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響Fig.3 Effect of rose flower addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.1.4 紅豆添加量對玫瑰紅豆復合米酒品質的影響

由圖4可知，隨著紅豆添加量增多，還原糖整體小幅度升高，總酸含量和酒精度變化不明顯。這可能是因為添加紅豆時帶入了淀粉，但短時間內這些淀粉對酒體酒精度影響不大。感官評定結果顯示，隨著紅豆添加量增多，復合米酒感官綜合評分先升高后降低，在紅豆添加量為15.0%時，感官評分最高，為82.3分。因此，選擇紅豆最適添加量為15.0%。

圖4 紅豆添加量對玫瑰紅豆米酒品質的影響Fig.4 Effect of red bean addition on the quality of rose and red bean compound rice wine

2.2 玫瑰紅豆復合米酒發酵工藝優化響應面試驗

2.2.1 Box-Behnken試驗設計與結果

基于單因素試驗結果，本試驗以酒曲添加量（A）、發酵時間（B）、玫瑰花添加量（C）及紅豆添加量（D）為影響因素，感官評分（Y）為響應值，運用響應面試驗設計優化玫瑰紅豆復合米酒發酵工藝。Box-Behnken中心組合試驗設計及結果見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計結果Table 3 Results of Box-Behnken experiments design

2.2.2 響應面試驗方差分析

借助Design Expert 8.0.6軟件，對試驗表3的數據進行回歸模型方差分析，結果見表4。以玫瑰紅豆米酒感官分析為響應值，得到多元二次回歸方程如下：

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，該優化擬合回歸模型P值＜0.000 1，模型極顯著，失擬項P值=0.067 1＞0.05，失擬項不顯著，說明該模型與試驗結果擬合程度較好，可以通過該模型確定玫瑰紅豆復合米酒的最佳發酵工藝。模型的決定系數R2=0.939 3，校正決定系數R2adj=0.878 7，變異系數（coefficient of variation，CV）=7.45%，說明該模型能解釋87.87%響應值的變化。分析各因素P值可知，一次項A、C、D、二次項A2、B2、C2、D2對玫瑰紅豆復合米酒的感官評分影響極顯著（P＜0.01），一次項B、交互項AB、BC、BD、CD對玫瑰米酒感官評分影響顯著（P＜0.05）。分析F值可知，影響玫瑰紅豆復合米酒感官評分的因素順序為：A酒曲添加量＞D紅豆添加量＞C玫瑰花添加量＞B發酵時間。

2.2.3 響應面試驗分析各因素交互影響

響應曲面和等高線是各因素對響應值影響的直觀反映[29]，從響應曲面的坡度可以看出其影響的顯著性，從等高線的形狀可以看出兩因素的交互關系[30]。各因素間的交互作用對玫瑰紅豆米酒感官評分影響的響應面及等高線見圖5。

圖5 各因素交互作用對玫瑰紅豆米酒感官評分影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factor on the sensory score of rose and red bean compound rice wine

由圖5可知，酒曲添加量和發酵時間、發酵時間和玫瑰花添加量、發酵時間和紅豆添加量、玫瑰花添加量和紅豆添加量之間交互作用對玫瑰紅豆米酒的感官評分有顯著影響（P＜0.05），這與表4的方差分析結果一致。

2.3 玫瑰紅豆復合米酒工藝優化驗證試驗

通過響應面試驗最大值預測，得出玫瑰紅豆復合米酒最佳發酵工藝條件為：酒曲添加量0.50%，發酵時間60.34 h，玫瑰花添加量1.76%，紅豆添加量14.07%。此發酵工藝條件下模型預測玫瑰紅豆復合米酒感官評分理論值為94.77分。根據模型預測結果，結合實際操作的可行性，最佳發酵條件修正為：酒曲添加量為0.5%，發酵時間為60 h，玫瑰花添加量為1.8%，紅豆添加量為14.0%。在此條件下進行3次平行驗證試驗，玫瑰紅豆復合米酒感官評分實際值為94.10分，與理論值94.77分基本接近，因此該模型預測結果比較可靠。

2.4 玫瑰紅豆復合米酒的指標測定

經檢測，最佳發酵工藝條件下生產的玫瑰紅豆米酒的酒精度為3.27% vol，還原糖含量為31.54 g/100 mL，總酸含量為7.95g/L，菌落總數＜50CFU/mL；大腸桿菌＜3MPN/100g。

3 結論

本試驗以富含花青素的玫瑰花和有行氣補血功效的紅豆以及糯米為原料，研制了一款香味協調的復合米酒。基于單因素試驗結果，采用響應面法優化工藝，得到玫瑰紅豆復合米酒的最佳發酵工藝：糯米中添加14.0%的紅豆，常壓蒸煮糊化，再添加1.8%玫瑰花和0.5%甜酒曲，拌和均勻，30 ℃恒溫發酵60 h。在此條件下得到的復合米酒均勻無沉淀，香氣芬芳雅致，口感清甜爽口，風格獨特，感官評分為94.1分。此產品為傳統米酒增添了新口感，為新型米酒的開發提供了參考。