microRNA在HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥中的研究進展

楊天宇(綜述)，呂雅蕾(審校)

(河北醫科大學第四醫院腫瘤內科，河北 石家莊 050011)

據統計，乳腺癌是女性第一高發惡性腫瘤，病死率位居女性腫瘤的第2位[1]。其中15%～20%的乳腺癌患者人表皮生長因子受體2(human epidermal growthfactor receptor 2，HER2)過表達或HER2原癌基因擴增[2]。HER2是一種跨膜糖蛋白，調控組織細胞增殖和分化，由胞外區、跨膜區和胞內區三部分組成。其中胞外區的Ⅱ、Ⅳ結構域分別含有帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的結合位點，二者都可通過與相應抗體彼此結合阻斷二聚體的形成而發揮抗腫瘤作用。跨膜區由α-螺旋結構組成，胞內區為激酶區和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate，ATP)結合位點，通過激酶磷酸化作用參與信號轉導[3]，啟動細胞內信號級聯反應，維持細胞的生存和發育，促進細胞增殖和遷移等。microRNA是一種長度在18～25 nt左右的內源性小分子非編碼RNA，通過調控至少30%以上的基因表達，參與機體細胞增殖、侵襲、轉移、耐藥等多種生理、病理過程。1993年第1個microRNA被發現，至今已被發現1 000多種，它們通過特異性結合于靶mRNA的3′-UTR區域，抑制靶mRNA翻譯或直接將其降解，抑制基因表達[4]。microRNA的異常表達影響下游基因、蛋白表達水平及相關受體突變情況等，在腫瘤的發生發展乃至治療效果中作用顯著，而其對基因或蛋白等受體的調控可通過激活HER2下游信號通路參與調控乳腺癌細胞增殖、轉移、侵襲及曲妥珠單抗耐藥等過程。

1 microRNA-375

王穎懿等[5]對41例乳腺癌患者與41例正常人進行的對照研究證實microRNA-375的表達在癌組織中均較正常組織表達要低。同樣一項針對經過病理證實的48例乳腺癌患者的回顧性分析[6]也表明microRNA-375在乳腺癌組織中呈現出顯著低表達，且表達水平與淋巴結轉移和HER2間存在相關性。這些都提示microRNA-375可以在一定程度上衡量判斷乳腺癌的預后及嚴重程度，隨著人們不斷深入的研究，發現microRNA-375與乳腺癌耐藥性相關，特別是與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥存在緊密聯系。

1.1上調胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1，IGF-1R)誘導耐藥 IGF-1R是一種跨膜受體，基因定位于染色體15q25-26，由跨膜的β亞單位與胞外的α亞單位構成，在核糖體中完成合成過程，屬于受體酪氨酸激酶。眾所周知，IGF-1R與HER2的下游信號通路相同，可能通過旁路激活磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin,mTOR)信號傳導通路，從而模擬HER2相關信號通路的激活，使原本靶向HER2的曲妥珠單抗產生耐藥性[7]。IGF-1R與HER2可相互交聯形成異二聚體，促進HER2磷酸化，拮抗IGF-1R的作用則有助于恢復曲妥珠單抗耐藥株的敏感性。另外，IGF-1R、HER3、HER2三者可結合形成三聚體，激活相關下游信號，若減少HER3或IGF-1R的表達,，也可增強曲妥珠單抗耐藥株的敏感性，說明IGF-1R信號激活與曲妥珠單抗耐藥關系密切[8]。乳腺腫瘤細胞中，microRNA-375與其靶基因IGF-1R呈顯著負相關，高表達的microRNA-375可通過下調IGF-1R抑制PI3K/AKT信號通路的活化程度，進而抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移、耐藥等生理病理過程；而在曲妥珠單抗耐藥的HER2陽性乳腺癌細胞中，microRNA-375因DNA甲基化和組蛋白去乙酰化發生表觀遺傳沉默，導致其靶基因IGF-1R的表達水平上調，進而通過活化PI3K/AKT信號通路誘導乳腺癌細胞產生曲妥珠單抗耐藥性[9]。

1.2調控上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)參與耐藥過程 EMT是指上皮細胞在某些特定的生理、病理條件下失去上皮表型而轉化為間質細胞的生物學過程，這一過程伴隨著各種蛋白標志物(如E-cadherin、Vimentin、鋅指/同源域蛋白ZEB1、細胞角蛋白等)的改變與相關信號通路(如TGF-β、TNF-α/NF-κB、Wnt/β-catenin等)的激活或抑制。EMT對腫瘤的發生、發展及轉移、耐藥方面具有重要意義，在誘導曲妥珠單抗耐藥的過程中也發揮著不可或缺的作用[10]。葉星明等[11]進行的關于HER2陽性乳腺癌親本敏感細胞株SKBR-3和耐藥細胞株SK-BR-3R對曲妥珠單抗的敏感性的研究顯示，耐藥細胞SK-BR-3R中miR-375、vimentin呈顯著低表達狀態，而E-cadherin的表達水平明顯上調；當將miR-375模擬物轉染耐藥細胞后，三者的表達水平均發生了逆轉。預測并選取異黏蛋白(metadherin,MTDH)基因作為miR-375的靶基因，發現miR-375能夠與MTDH miRNA的3′UTR發生特異性靶向結合，將特異性針對MTDH基因的siRNA轉染到SK-BR-3R中，發現與miR-375過表達時結果一致，MTDH表達水平明顯下調，E-cadherin和vimentin的表達水平均發生了逆轉。由此可見microRNA-375通過調控EMT參與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥；這一作用可能與靶向調控MTDH表達有關。Hu等[12]研究同樣證實，過表達的MTDH與乳腺癌的預后不良、轉移風險的增加相關聯，表明miR-375可能通過對MDTH的調節發揮與乳腺癌相關的耐藥作用。

因此，microRNA-375可作為潛在的靶點逆轉Trastuzumab在HER2陽性乳腺癌中的耐藥情況。

2 microRNA-21

2.1抑制程序性細胞凋亡因子4(programmed cell death 4，PDCD4)或直接作用于PTEN促進腫瘤進展 多項研究證實，與正常乳腺組織相比，microRNA-21在乳腺癌細胞中呈過表達狀態[13]。高表達的miRNA-21可通過抑制PDCD4的活性使之失活或表達減少，也可直接作用于PTEN的3′UTR，下調PTEN的表達，促進乳腺癌細胞的異常增殖、侵襲和遷移[14]。PTEN可特異性催化三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol trisphosphate，PIP3)去磷酸化，降低PIP3的水平，進而負向調控PI3K/AKT信號通路，抑制細胞的過快生長及分化。而PI3K/AKT通路的持續活化可有效降低HER-2陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性，因此，PTEN基因缺失或突變被認為是曲妥珠單抗耐藥的標志性事件[15]。

2.2抑制PDCD4或直接作用于PTEN誘導耐藥 Gong等[16]的研究表明，在經過體外培養和裸鼠體內培養獲得Trastuzumab耐藥的HER2陽性乳腺癌細胞中，miRNA-21都呈現過表達狀態，同時發現miRNA-21通過介導PTEN沉默降低PTEN的表達，誘導Trastuzumab耐藥性的產生；當耐藥細胞中的miRNA-21被反義寡核苷酸干擾下調后，PTEN的表達水平發生逆轉，并且恢復了對曲妥珠單抗的敏感性。因此上調miRNA-21可誘發曲妥珠單抗耐藥。De等[17]也通過相關體內外的研究實驗，顯示miRNA-21可作為HER2陽性乳腺癌中維持上皮間質轉化及構造腫瘤免疫微環境的信號，一旦上調或異常表達，便會破壞此平衡，導致曲妥珠單抗耐藥，同時證實miRNA-21能夠直接靶向PDCD4和PTEN，介導二者表觀遺傳沉默，尤其是PTEN，很可能是miRNA-21高表達的HER2陽性乳腺癌產生曲妥珠單抗耐藥性的重要機制。

3 microRNA-200c

3.1靶向zeb1/zeb2抑制腫瘤進展 Zeb1(也被稱為δef)和Zeb2(也被稱為sip1)是EMT的兩種主調控因子，通過直接控制抗轉移黏附分子E-鈣黏蛋白的轉錄啟動EMT。研究顯示，miRNA-200c可通過抑制ZEB1、ZEB2，恢復E-鈣黏蛋白的水平，進而通過拮抗EMT的功能，顯著減少乳腺癌細胞的遷移和侵襲，增強乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性[18]。miRNA-200c在乳腺癌中顯著降低，從而使靶標分子ZEB1與ZEB2上調，進而上調E-鈣黏蛋白的表達水平，Zeb1、Zeb2都能夠通過結合到E-鈣黏蛋白啟動子內的兩個二分體E-盒基序啟動EMT，抑制其轉錄，最終使腫瘤細胞侵襲、轉移力及耐藥性顯著增強。

3.2靶向ZNF217和Zeb1對耐藥產生 作為EMT的主要調節器，TGF-β信號在調節乳腺癌的惡性表型及耐藥性中發揮重要作用[19]。在曲妥珠單抗耐藥細胞中檢測到microRNA-200c下調及TGF-β信號顯著升高，并導致乳腺癌的高侵襲性。在乳腺癌中，miRNA-200c可以直接靶向調控乳腺癌ZEB1與ZNF217的表達。microRNA-200c下調，作用于ZNF217，ZNF217上調自分泌TGF-β，通過轉錄激活TGF-β促進EMT，而Zeb1是EMT中TGF-β信號的介導物。TGF-β參與EMT誘導途徑，通過損害上皮黏附蛋白E-鈣黏蛋白的表達或功能觸發上皮細胞去分化，同時TGF-β信號轉錄激活zeb1，導致基因表達譜改變[20]，對microRNA-200c產生反饋抑制作用，從而增加乳腺癌細胞的侵襲性與耐藥程度。通過miRNA microarray篩選同樣顯示miRNA-200c在曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細胞中的表達水平顯著降低，并證實了miRNA-200c可以同時提高乳腺癌對曲妥珠單抗的敏感性、降低細胞侵襲和遷移能力、逆轉EMT并抑制腫瘤轉移。

microRNA-200c的恢復、ZEB1或ZNF217的沉默或TGF-β信號傳導的阻斷均能提高曲妥珠單抗的敏感性，抑制乳腺癌細胞的侵襲性。

4 microRNA-221

4.1microRNA-221的特征與表達 microRNA-221位于Xp11.3染色體上，屬miRNA-221/222基因家族，和miRNA-222擁有相同的種子序列。多項研究表明miRNA-221在甲狀腺癌、胰腺癌、結腸癌等多種惡性腫瘤組織中表達異常增高，且具有癌基因作用[21-22]。強表達的miRNA-221與腫瘤的發生、發展、侵襲及轉移等密切相關。衛淑芳等[23]研究顯示乳腺癌患者血漿miRNA-221過表達，其表達水平在治療前后均與腫瘤分期及耐藥呈正相關。

4.2microRNA-221通過靶向PTEN調節曲妥珠單抗耐藥 高表達的miRNA-221不僅可以使乳腺癌細胞對他莫西芬的耐藥性增強，還能夠明顯促進T47D或MCF-7等乳腺癌細胞對多西他賽的耐藥性[24]，同時，miRNA-221也是曲妥珠單抗耐藥性產生過程中的一個關鍵因素，Ye等[25]針對HER2陽性乳腺癌細胞SK-BR-3進行的體外研究實驗顯示，將miRNA-221前體的重組慢病毒導入SK-BR-3后，miRNA-221傳遞高效、表達增加，轉染相應的合成抑制劑干擾miRNA-221則使其表達水平顯著下降；當暴露于Trastuzumab時，SK-BR-3因miRNA-221被抑制而大量凋亡，上調miRNA-221的表達則抑制了SK-BR-3對曲妥珠單抗的敏感性，使其凋亡數目大大減少。同時在過表達miRNA-221的裸鼠體內發現了肺部轉移性結節，對照組則未有相關發現。因此miRNA-221過表達可有效抑制HER2陽性乳腺癌細胞凋亡，促進其侵襲、轉移，并降低其對曲妥珠單抗的敏感性。進一步研究顯示miRNA-221與PTEN的表達呈明顯負相關，并且PTEN的強表達可顯著抑制miRNA-221誘導的HER2陽性乳腺癌細胞的侵襲，大幅度恢復了其對Trastuzumab的敏感性。因而上調miRNA-221可以靶向PTEN參與HER2陽性乳腺癌曲妥珠單抗耐藥性的產生。

5 其他microRNA

葉秋文等[26]采用miRNA-30 d的模擬物和抑制物轉染到HER2過表達和低表達的乳腺癌細胞中，并對細胞中miRNA-30 d、自噬相關基因Beclin 1和LC 3的表達情況以及曲妥珠單抗耐藥的程度進行分析，結果表明miRNA-30 d在HER2高表達的乳腺癌細胞中過表達，且能使Beclin 1和LC 3的表達明顯下調，同時可顯著增強BT474細胞對曲妥珠單抗的敏感性，而轉染miRNA-30 d抑制劑降低其表達后，BT474細胞的耐藥性則明顯升高。上述研究結果證實miRNA-30 d可能通過調控Beclin 1和LC 3的表達影響赫賽汀耐藥過程的產生。Li等[27]研究顯示，HER2 3′未翻譯區(3′UTR)所介導的HER3上調促進乳腺癌細胞的增殖、生長，同時導致HER2陽性乳腺癌患者對Trastuzumab治療的抵抗；含miR-125a/b元件的HER2 3′未翻譯區可誘導miR-125a/b的解離，下調HER3 mRNA，從而恢復癌細胞對Trastuzumab的敏感性。強表達的miRNA-182可能通過靶向抑制下游的FOXO1基因，降低HER2陽性乳腺癌細胞對曲妥珠單抗的敏感性[28]。lncRNA-UCA1通過miR-18a靶向YAP1調節乳腺癌Trastuzumab耐藥，其中miR-18a通過抑YAP1和CDK6，促進PTEN表達，進而增強曲妥珠單抗的治療療效[29]。

6 結 語

microRNA家族中，越來越多的microRNA與HER2陽性乳腺癌細胞轉移和曲妥珠單抗耐藥相關。作為HER2陽性乳腺癌侵襲、轉移、曲妥珠單抗耐藥的關鍵因素，microRNA很可能成為潛在的靶點，為HER2陽性乳腺癌的治療及逆轉曲妥珠單抗耐藥提供新方法。而曲妥珠單抗耐藥與microRNA、HER2之間有著密不可分的聯系，目前已有通過已知的耐藥機制研發出的關于逆轉乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的研究成果(如帕妥珠單抗、T-DM1、依維莫司)應用于臨床，并取得一定療效，但仍需進一步探索，開發出更有效的臨床藥物逆轉耐藥。

綜上所述，研究microRNA家族在HER2陽性乳腺癌中的作用及其機制，不僅為HER2陽性乳腺癌患者的治療及靶向藥物研發提供了理論指導，也為逆轉HER2陽性乳腺癌耐藥策略的建立提供科學依據。