綠原酸對仔豬腹瀉的調控作用及機理

謝凱桓，張云露，張龍林，李思明，賀 喜，范志勇*

（1.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南長沙 410128；2.飼料安全與高效利用教育部工程研究中心，湖南畜禽安全生產協同創新中心，湖南長沙 410128；3.江西省農業科學院畜牧獸醫研究所，江西南昌 330200）

仔豬健康是養豬生產中的重要問題，消化道、免疫、環境、日糧和病原體等諸多內外因素均可對仔豬的健康和生長發育產生不利影響[1]。仔豬腹瀉主要是由于消化道和免疫功能發育不完善，外來不可抗力對仔豬內環境進行侵襲，多發于仔豬幼齡階段。為治療仔豬腹瀉，抗生素在養豬業中曾被大量使用，但抗生素殘留、耐藥性的產生以及環境污染對養殖生產和人類健康帶來威脅，因此新型替抗產品的研究成為熱點。

綠原酸（Chlorogenic Acid，CGA）又被稱為5-O-咖啡酰奎寧酸（5-CQA）或3-CQA[2]，是羥基肉桂酸家族的酚類化合物，其化學結構由咖啡酸部分和奎寧酸部分組成。CGA 廣泛存在于杜仲、菊花、金銀花及苦丁茶等植物中，其具有抑菌和抗氧化等多種生物活性，對仔豬腹瀉有一定治療效果，已被廣泛應用于畜禽生產中[3-7]。因此，本文就仔豬腹瀉的可能誘因、CGA 在仔豬生產中的應用及其緩解仔豬腹瀉的可能機制進行綜述，為CGA 的進一步研究提供參考。

1 仔豬斷奶應激導致的腹瀉

仔豬腹瀉多發生于斷奶后，斷奶過渡期是仔豬生長周期的關鍵。早期斷奶策略縮短了豬的屠宰周期，提高了母豬的繁殖性能，已廣泛應用于豬生產中[8]。但仔豬失去母乳哺乳后，日糧結構和環境的突然轉變均可引起仔豬發生斷奶應激，進而影響其生長性能及腸道健康，導致仔豬腹瀉率，增加了仔豬死亡率，并降低生長性能[9-10]。此外，細菌、病毒和寄生蟲等許多因素也會引發豬的腸道功能障礙問題[11-13]，其中，大腸桿菌是導致仔豬腹瀉的一種常見細菌。Wu 等[14]研究發現，產腸毒素性大腸桿菌（ETEC）菌株可引起人和動物腸道功能障礙和損傷，并造成仔豬腹瀉。Mohamed 等[15]研究發現，仔豬感染ETEC 后會發生腹瀉，導致其脫水、發育遲緩甚至死亡，其病理性特征是產生腸毒素和黏附素。ETEC 攻毒后仔豬絨毛高度縮短，隱窩深度加深，空腸杯狀細胞數量減少，回腸中緊密連接蛋白claudin-1 的mRNA 表達量下降，而淋巴細胞百分比、血漿白細胞介素-1β（IL-1β）、回腸黏膜中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）以及回腸組織中先天免疫相關基因的mRNA 表達量上升[16]。此外，ETEC 感染仔豬后會使其腸道微生物區系和腸道微生物失調[17]。López 等[18]用鼠傷寒沙門氏菌或ETEC 對仔豬進行攻毒后發現，仔豬出現輕度至重度腹瀉，并且使得腸脂肪酸結合蛋白（I-FABP）、豬主要急性期蛋白（Pig-MAP）和TNF-α上升。研究表明，豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒A（PRV-A）、豬曲布病毒（PKV）和豬三角冠狀病毒（PDCoV）是導致仔豬腹瀉的主要病毒，大多數屬于RNA 病毒，其中輪狀病毒是引起新生仔豬腹瀉的主要病原體[19-21]。豬中常見的艾美耳球蟲、等孢球蟲和隱孢子蟲等寄生蟲是仔豬腹瀉的誘因之一，該病常在哺乳期仔豬中出現且在其他階段均有分布，可導致7～21日齡仔豬腸絨毛萎縮，輕度吸收不良以及腹瀉[13,22]。

2 CGA 對仔豬腹瀉和生產性能的影響

飼糧中添加CGA 能改善腸道健康、緩解仔豬斷奶后的應激反應并降低仔豬腹瀉率、提高仔豬的生長性能和抗逆能力[23]。Chen 等[24]給斷奶仔豬分別飼喂添加0、250、500、1 000 mg/kg CGA 的基礎日糧，發現1 000 mg/kg CGA 組仔豬的平均日增重和飼料轉化率顯著高于對照組，有效降低了仔豬腹瀉率，同時提高了仔豬粗蛋白質、粗脂肪和灰分的表觀消化率，血清中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、過氧化氫酶（CAT）活性和堿性磷酸酶（AKP）活性均顯著升高。Zhang 等[25]試驗也證明，飼糧中添加CGA 后仔豬血清和十二指腸中GSH-Px 和CAT 活性均顯著升高，回腸丙二醛（MDA）含量降低，還能顯著降低了十二指腸隱窩深度，提高了絨毛高度和絨隱比。此外，Chen 等[26-28]給斷奶仔豬飼喂含1 000 mg/kg CGA 的基礎日糧，發現可提高仔豬空腸絨毛高度、絨隱比以及回腸絨隱比，能顯著增加仔豬小腸長度，有效改善仔豬消化吸收能力，同時降低血清TNF-α、白細胞介素-6（IL-6）和IL-1β等抑炎因子含量，提高血清中免疫球蛋白G、空腸分泌型免疫球蛋白A 的含量和黏膜中二胺氧化酶（DAO）的活性。與此同時，CGA 還能調節腸道菌群。給斷奶仔豬飼喂含1 000 mg/kg CGA 的基礎日糧可顯著提高回腸消化物中的乙酸鹽濃度以及盲腸消化物中乙酸鹽、丙酸和丁酸鹽的濃度，從而提高了盲腸菌群α多樣性，特別是擬桿菌的相對豐度，還使得結腸中乳酸菌數量增加，大腸桿菌數量減少[25,28]。綜上所述，飼糧中添加CGA可以改善仔豬的生長性能，增強仔豬免疫力，促進腸道發育并能調節其腸道微生物區系平衡，具有作為仔豬飼糧添加劑的潛力，其最佳添加劑量為1 000 mg/kg。

3 CGA 改善仔豬腹瀉的可能機制

3.1 CGA 的吸收和代謝 CGA 進入機體后，少部分被胃和小腸吸收，大部分被大腸吸收，但CGA 在不同的部位分解會產生不同的代謝產物，吸收機制方面也存在差異。Wang 等[29]和Li 等[30]對SD 大鼠體內CGA 代謝產物進行了表征，通過水解、還原、甲基化、甘氨酸結合及葡糖醛酸結合等推導出18 個原型化合物和50 個代謝產物，主要是咖啡基奎寧酸、二咖啡?？鼘幩?、對香豆酰奎寧酸和阿魏酸。有研究證明了CGA 可被胃、小腸、大腸吸收，并且CGA 是通過穿透胃酸屏障進入細胞，CGA 到小腸后，小腸中的葡糖醛酸基轉移酶使CGA 在小腸中大多以葡糖苷酸化形式吸收，而糖苷酶和酯酶可使CGA 酯鍵斷裂釋放奎尼酸和咖啡酸，但小腸中酯酶活性低，因此CGA 分解代謝少[31-33]。還有研究證明CGA 僅約1/3 能被胃及小腸吸收，意味著一部分CGA 會進入血液循環，大部分會到達結腸，經腸道菌群作用下水解為咖啡酸和奎寧酸[34-35]，同時還能產生間香豆酸、苯丙酸、苯甲酸和馬尿酸衍生物等多種代謝產物，這些微生物代謝產物占CGA 攝入量的57.4%，豐富的微生物代謝產物表明腸道菌群對CGA 的代謝水平一定程度上決定了CGA 的生物利用度[36-37]。

3.2 調節腸道菌群 機體攝入的CGA 大部分被大腸吸收代謝，CGA 達到大腸后可對腸道菌群進行調控，進而增加其腸道微生物區系多樣性。Charlotte 等[38]在體外試驗中發現CGA 可顯著增加人糞便微生物區系中雙歧桿菌和梭狀芽胞桿菌的含量。Zhang 等[39]在對小鼠糞便微生物群中細菌相對豐度的研究中發現，CGA 可逆轉葡聚糖硫酸鈉（DSS）引起的菌群多樣性下降，提高了乳酸桿菌屬的相對豐度，表明CGA 能通過恢復腸道微生物多樣性來減輕DSS 誘導的結腸損傷并維持腸道健康。此外，ETEC 感染仔豬后會使其腸道微生物區系和腸道微生物失調[17]。Song 等[40]試驗表明，CGA預處理能改善促腎上腺皮質激素（ACTH）所致的抑郁大鼠糞便微生物多樣性下降，特別是脫硫弧菌、克雷伯氏菌、伯克氏桿菌和雙歧桿菌等一些關鍵細菌的相對豐度變化均受CGA 調節。鉛（Pb）被廣泛認為是有毒的重金屬。研究發現，CGA 對Pb 引起的腸道微生物組分變化同樣具有顯著的逆轉作用，可使Pb 組螺桿菌屬的比例從2.95% 提高到11.24%[41]。Akkermansia是腸道中降解黏蛋白的細菌。Zhang 等[42]研究發現，CGA 能顯著增加結腸炎小鼠中Akkermansia的比例。

3.3 保護腸道形態及屏障 腸道縮短使機體不能充分吸收其中的水分、電解質及營養物質等，進而發生腹瀉及消化吸收功能障礙等問題[43]。張柏林等[44-46]研究發現，DSS 可誘導小鼠結腸炎，引起小鼠體重下降、結腸縮短造成腹瀉；肉雞被脂多糖（LPS）刺激后其腸道也會縮短。而Zheng 等[47]研究發現，使用CGA 可明顯緩解DSS 所致的臨床癥狀和結腸縮短等問題，還可降低LPS所致的斷奶大鼠的腸道通透性并增加腸道緊密連接蛋白的表達，與LPS 組相比，添加CGA 可使大鼠空腸和回腸絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度之比增加，空腸和結腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達量明顯增加。Xue 等[48]研究表明，CGA 能改善鎘（Cd）所致的大鼠絨毛損傷，逆轉對緊密連接蛋白的破壞，起到保護腸道屏障的作用。Peng 等[49]也有相似的發現，GCA 通過下調高脂日糧（HFD）誘導的小鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）中RhoA/Rho 激酶（Rock）信號通路恢復結腸緊密連接蛋白的表達，到達保護腸道屏障的目的。綜上所述，CGA 可促進腸道形態恢復，保護腸道屏障，是減少仔豬腹瀉及提高生長性能的有效措施。

3.4 提高腸道抗氧化力 新生仔豬發育尚不成熟及斷奶應激等因素可導致仔豬體內產生過量自由基，而自由基過量會損傷仔豬腸道，進而誘發仔豬腹瀉[50]。CGA 具有改善腸道氧化應激的作用。Orsolya 等[51]、Xu 等[52]證明CGA 對LPS 和脫氧雪腐烯酚（DON）誘導的腸上皮細胞（IPEC-J2）炎癥和氧化應激有保護作用，能夠顯著下調炎癥細胞因子IL-6 和IL-8 的基因表達和濃度，降低了IPEC-J2 細胞中活性氧水平。Liang 等[53]研究也發現，CGA 能清除腸細胞內活性氧，增加還原性及氧化性谷胱甘肽的表達，激活核因子E2 相關因子2（Nrf2）信號轉導，Nrf2 信號的增加導致其靶基因在CaCO-2 細胞中的表達上調，進而激活了Nrf2-Keap1-ARE 信號通路。Xue 等[48]試驗表明，經Cd 處理的大鼠血清中CAT 和GSH-Px 活性明顯降低，MDA 水平升高，而使用CGA 和向日葵種子提取物共同處理可讓CAT 活性和MDA 水平恢復到對照組的水平，并且CGA 組大鼠GSH-Px 活性的增加明顯高于Cd 處理組。Zhou 等[54]還證明了CGA 能有效改善內毒素所致腸損傷，增加小腸重量，降低回腸和回腸線粒體MDA 含量，提高回腸AKP、SOD、回腸線粒體β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）還原性脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活性；另一方面，腸通透性與腸道線粒體損傷呈正相關，可以通過回腸線粒體MDA 水平反應出，并且又與NADH脫氫酶活性呈負相關，由此發現，CGA 保護腸道損傷可能與線粒體脂質過氧化水平降低和NADH 脫氫酶活性升高有關。該學者還通過研究CGA 對線粒體的保護作用，發現CGA 預處理可減輕H2O2引起的腸道線粒體損傷，增加線粒體膜電位，降低線粒體腫脹，降低ROS 及8-羥基-2-脫氧鳥苷含量，減少細胞色素c 釋放，可知CGA 對線粒體的促進作用伴隨著抗氧化能力和呼吸鏈復合物I、IV 和V 活性的增加[55]。CGA 作為一種線粒體靶向抗氧化劑，在對抗腸道氧化損傷方面有很好的潛力，它能通過提高仔豬的抗氧化能力促進仔豬生長，降低腹瀉。

3.5 改善腸道炎癥反應 腸道炎癥反應是腹瀉發生發展的病理生理基礎，CGA 可通過減少促炎性細胞因子的產生減輕腸道損傷，特別是在結腸部位[56]。Peng 等[49]研究發現，梔子苷與CGA 組合可抑制腸源性脂多糖（LPS）的信號轉導，包括肝LPS 結合蛋白、Toll 樣受體4、IL-1β、TNF-α和枯否細胞浸潤。在DSS 誘導的小鼠結腸炎模型中，CGA 預處理2 周后可顯著降低小鼠結腸組織學評分和TNF-α水平[39]。Zhang 等[42]研究發現，CGA 可減輕2.5% DSS 引起的結腸炎，改善黏膜損傷，通過抑制活化的核因子-κB（NF-κB）信號通路，顯著抑制干擾素γ（IFN-γ）、TNF-α和IL-6 的分泌，抑制F4/80+巨噬細胞、CD3+T 細胞和CD177+中性粒細胞的結腸浸潤。Iva 等[45]用2.5% DSS 對小鼠灌胃7 d，CGA 可抑制磷酸化的細胞外信號調節激酶1 和2（ERK 1/2）、c-Jun 氨基末端激酶1 和2（JNK 1/2）、蛋白激酶B（Akt）和信號轉導子及轉錄激活因子3（STAT3），同時促進磷酸酶和張力素同源酶（PTEN）的表達，抑制促炎細胞因子TNF-α、B 淋巴細胞瘤-相關X 蛋白2（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-8（caspase-8）、半胱氨酸蛋白酶-9（caspase-9）和血紅素加氧酶-1（HO-1）蛋白的表達，因此CGA 能通過抑制促炎和凋亡信號通路的激活治療或減輕小鼠結腸炎。Gao 等[57]同樣發現，CGA 可通過降低ERK 1/2、磷酸化細胞外信號調節激酶（p-ERK）、p38、磷酸化P38（p-p38）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（p-JNK）蛋白的表達，進而減輕DSS 引起的小鼠結腸黏膜損傷。Hee 等[46]在體外試驗中發現，CGA 可抑制經TNF-α和H2O2刺激后Caco-2 細胞中中白細胞介素-8（IL-8）的產生；在體內DSS 誘導的小鼠結腸炎模型中，CGA 可顯著抑制小鼠TNF-a 的mRNA 表達，其可能機制為直接抑制NF-κB 的激活，或通過抑制上游信號通路間接影響NF-κB 信號傳遞。另外，CGA 還可緩解三硝基苯磺酸誘導的小鼠結腸炎，CGA 通過減少中性粒細胞浸潤和抑制NF-κB 依賴性途徑而具有抗炎作用[58]。因此，CGA 作為一種抗炎物質，能通過多種途徑降低仔豬腸道炎癥，特別是抑制NF-κB 信號通路，進而緩解仔豬腹瀉。

4 小 結

改善腸道健康是解決仔豬腹瀉的關鍵，隨著研究的不斷深入，仔豬腹瀉的發生和發展機制逐漸清晰，從而能夠對仔豬腸道進行更加精準化、動態化和靶向性的營養調控，以維持仔豬腸道內穩態平衡，預防或減少腹瀉等腸道疾病的發生。CGA 可以通過提高菌群豐度，降低腸道氧化損傷及炎癥等方式保護腸道形態、促進營養物質的吸收，調節仔豬腸道健康，從而提高仔豬生長性能，有作為仔豬飼料添加劑的潛力，但CGA 在仔豬階段的報道較少，在仔豬腸道中的作用機制仍需進一步研究。