DNA胞嘧啶的甲基化與去甲基化進展

宋星睿， 凌曉婷， 趙楚斌， 賴瑋毅， 汪海林

(1.中國科學院生態環境研究中心，北京 100085；2.國科大杭州高等研究院，浙江杭州 310024)

1 DNA甲基化

表觀遺傳修飾，主要是指研究非DNA序列變化的其他途徑與機理所引起的可遺傳性的基因表達改變[1,2]。DNA甲基化是一類較為重要的表觀遺傳修飾，除此外還有組蛋白修飾以及多種小RNA等其他方式[3 - 5]。DNA甲基化一般是由DNA序列中的胞嘧啶、腺嘌呤的C或N上的H被CH3所替代，而形成甲基化修飾[3 - 5]，如5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine,5mC)、N6-甲基腺嘌呤(N6-Methyladenine,6mA)、N4-甲基胞嘧啶(N4-Methylcytosine,4mC)。5mC是哺乳動物基因組DNA中含量最高的甲基化修飾，占總胞嘧啶的3%～5%[6]。DNA 5mC修飾主要發生在DNA序列上胞嘧啶接著鳥嘌呤出現的位點，稱為CpG位點(CpG sites)。哺乳動物DNA C5-胞嘧啶甲基化轉移酶有3種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。在胚胎發育過程中，DNMT3a和DNMT3b將兩條鏈均不含5mC的DNA甲基化，從頭建立DNA的甲基化，被稱為從頭甲基化酶(denovoMethyltransferase)；而DNMT1則傾向于甲基化雙鏈DNA中半甲基化CpG位點，這一甲基化過程發生在DNA半保留復制中，將新鏈甲基化，維持了該DNA原本的甲基化狀態，因此DNMT1被稱為維持甲基化轉移酶(Maintenance Methyltransferase)。此外，在嚙齒動物中還存在一種從頭甲基化酶DNMT3c，在精子生成過程介導雄性生殖細胞的逆轉錄轉座子的啟動子甲基化[7]。

組織內DNA甲基化的分布與豐度，可用于某些疾病的診斷與治療，目前DNA甲基化分析已開始應用于臨床診斷。例如，進食障礙(Eating Disorders，ED)與內穩態通路DNA異常甲基化有密切的聯系，預期DNA甲基化的分析和表征有助于發展更有效的ED的治療方法[8]。在癌癥的診斷上，DNA甲基化也可作為腫瘤診斷及預后康復的標記物[9]。緊密連接蛋白1(Tight junction protein 1，ZO -1)甲基化檢測試劑盒可以用于急性白血病的診斷[10]；此外，DNA結合因子抑制劑4(Inhibitor of DNA binding 4，ID4)和ZO -1的異常甲基化可以作為淋巴瘤診斷的生物標記物；尿液中谷胱甘肽硫轉移酶P1(Glutathione S-transferase P1，GSTP1)基因的甲基化產物可用于前列腺癌的診斷[11]等。

2 DNA 5-甲基胞嘧啶去甲基化

DNA去甲基化是將已甲基化堿基轉化為不含甲基化修飾堿基的過程，是DNA甲基化的逆過程[12,13]。DNA甲基化和去甲基化在生物體內一般處于動態平衡，共同調控著基因的時空表達[14]。目前的研究認為，DNA 5mC去甲基化過程復雜度遠大于DNA甲基化，大致可分為被動去甲基化(Passive DNA demethylation)與主動去甲基化(Active DNA demethylation)兩種途徑。被動去甲基化主要發生在DNA復制過程，復制產生的新鏈均為非甲基化DNA，如新鏈沒有被維持甲基化轉移酶甲基化，則5mC被逐步稀釋，總體水平下降。DNA主動去甲基化則是CH3在各種酶的作用下被移除，目前動植物DNA主動去甲基化已有一定研究，但有關機制仍需進一步解釋。

植物體內DNA去甲基化過程主要為主動去甲基化，由ROS1/DME酶介導的堿基切除修復(Base Excision Repair，BER)通路進行[15,16]。ROS1突變體的形成可能會使RD29A基因啟動子區域的基因DNA甲基化水平顯著升高，并最終導致表達沉默[17]。Gehring等[18]發現，當種子胚乳中DME突變體產生時，CG基因DNA甲基化水平同樣顯著升高，預示著DNE突變體具有與ROS1突變體一致的作用。

哺乳動物5mC氧化去甲基化路徑的發現，對5mC去甲基化研究意義重大。2009年，Rao研究組發現，在哺乳動物腦組織和胚胎干細胞中，DNA 5mC可通過TET1酶催化氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)[19]，Purkinje細胞DNA中5hmC占0.59%，顆粒細胞DNA中5hmC占0.23%等[20 - 22]。一般哺乳動物5hmC含量可分為三類：神經元組織和胚胎干細胞中的高表達(0.3%～0.7%)；腎臟、膀胱、心臟等的中度表達(0.15%～0.17%)；肝臟和內分泌腺的低表達(0.03%～0.06%)。后續研究發現，TET蛋白可進一步將5hmC氧化為5甲酰基胞嘧啶(5-formylcytosine，5fC)、5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine，5caC)兩種重要修飾。這兩種修飾可通過堿基修復機制除去，使5mC回復到無修飾胞嘧啶狀態，實現5mC主動去甲基化[19,22]。并且TET蛋白催化5mC至5hmC的轉化速率遠快于5hmC至5fC和5fC至5caC的轉化速率[23]。

一些小分子物質也可改變細胞內5hmC、5fC和5caC水平，如維生素C可作為輔助因子與Tet酶的直接作用，顯著提高Tet蛋白介導的5mC氧化，經維生素C處理的小鼠胚胎干細胞基因組5hmC水平可由0.1% 提高至0.3%，5fC水平由7.7×10-6提高至8.1×10-6，5caC水平則提高了20倍[24]。此外，環境污染物醌類化合物可增強細胞內TET蛋白活性[25]；而典型環境內分泌干擾物雙酚A、雙酚S均可調控TET基因轉錄和表達，影響細胞內5hmC水平[25]。

在堿基切除修復通路中，尿嘧啶DNA糖苷酶家族胸腺嘧啶糖苷酶(Thymine DNA Glycosylase,TDG)具有進行G/T錯配修復的能力，在堿基切除修復路徑，發現TDG具有新的功能，負責識別和切除5fC和5caC修飾。另外，TDG的特殊結構位點使其在AID或載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(APOBEC) 存在時通過脫氨反應，在Gadd45a的協助下識別去除5fC等去甲基化中間產物，最終達到將5mC∶G修復成未經修飾的C∶G的目的[26]。TDG調控的DNA去甲基化在胚胎發育過程中可能發揮了重要作用。有研究發現，哺乳動物胚胎干細胞與人類生殖細胞的甲基化水平都會經歷高度甲基化-去甲基化-重新甲基化過程[27]。在對小鼠的TDG基因敲除實驗中，缺失TDG的小鼠胚胎會在發育早期(約12a)即出現死亡，并且在死亡胚胎中觀察到了多種發育障礙[28]。胚胎發育階段，TDG保護與調控發育相關的基因啟動子，使其不被甲基化而表達沉默，維持了胚胎細胞的正常發育[29]。

哺乳動物中DNA去甲基化不僅可以影響胚胎發育、分化等發育過程，還會對生物體正常生理代謝活動起到調控作用。例如，DNA去甲基化可能影響哺乳動物脂肪沉積。Melzner等人[30]通過對前脂肪細胞分化時Leptin基因啟動子區甲基化程度進行分析，發現了脂肪細胞進行分化期間，該基因啟動子區甲基化狀態也呈顯著下降狀態，即從前脂肪細胞向分化末期的成熟脂肪細胞轉化過程中，Leptin基因啟動子區從高度甲基化向高度去甲基化轉變。當人工干預年輕細胞體基因組DNA去甲基化后，細胞體在連續傳代后更容易出現如DNA合成能力下降等衰老的特征，提示了DNA去甲基化對細胞衰老的影響[31]。后續相關研究表明，DNA去甲基化會引起人二倍體成纖維細胞端粒縮短，從而加速人體細胞衰老[32]。總體而言，DNA去甲基化會對哺乳動物細胞體生長發育、分化、生命代謝活動等多方面起到調控作用。

3 疾病中的甲基化與去甲基化

DNA胞嘧啶異常甲基化包括基因組整體低甲基化和基因特定區域高甲基化，在各種形式的癌癥中都很常見，與腫瘤的發生和發展密切相關，而DNA去甲基化異常也會對機體正常代謝產生不利影響[33]。因此，DNA甲基化去甲基化與疾病的關系、甲基化去甲基化作為疾病標記物、干涉甲基化去甲基化過程治療疾病的研究受到廣泛關注。目前已有相關實驗或流行病學調查發現的與DNA甲基化與去甲基化異常有直接關聯的疾病有惡性腫瘤(癌癥)、阿爾茨海默氏病、心血管疾病(如冠心病等)、肺纖維病變和進食障礙等。

3.1 基于DNA 5mC去甲基化中間產物的癌癥診斷

腫瘤發生過程中，一些關鍵基因的胞嘧啶甲基化狀態發生改變，因此機體DNA甲基化模式和水平變化的分析對腫瘤的早期診斷及預后評估是尤為重要的[34,35]。其中，DNA去甲基化的中間產物5hmC也與腫瘤細胞的發展密切相關。因此，5hmC水平的變化可以預示某些腫瘤的發生，并在臨床中作為可靠的腫瘤診斷標記物[4]。例如，5hmC和5fC在肝癌組織中均顯著下降，5fC水平可區分肝癌的發展階段，肝癌基因組5hmC和5fC整體水平下降與肝癌患者預后不良有關；5hmC水平的降低對于診斷結腸癌也有重要的參考意義，可基于此進行前腺癌的診斷[36]。在circulating tumor DNA、循環瘤DNA(ctDNA)中，同樣可基于5hmC水平變化進行臨床癌癥診斷及5hmC作為預后標記物。在不同的癌癥和癌癥不同分期階段，ctDNA中5hmC水平會呈現顯著差別[37]。因此，可根據不同患者特定組織細胞體DNA甲基化水平的特點，對其患癌的可能性及類型進行合理預判和分析，甚至存在用血液樣本分析癌癥的可能性[38]。

TDG介導的DNA 5mC去甲基化同樣與惡性腫瘤的發生發展具有密切聯系。例如在胰腺癌[39]、食道癌[40]和直腸癌[10]等惡性腫瘤疾病中均可發現TDG的異常性表達。未來研究腫瘤發展與TDG介導的DNA去甲基化的相關性，可能有助于我們理解腫瘤發生發展的內在機理。

3.2 阿爾茨海默氏病

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)是一種以認知、記憶和語言功能等漸進性減弱，或產生障礙為主要癥狀的神經退化性疾病，該疾病由遺傳因素與非遺傳因素所共同作用，其中約70%發病風險為遺傳性因素[41]。對小鼠的AD模型研究發現，小鼠模型的大腦皮質基因組5mC含量在不同階段分別產生了不同波動，提示DNA甲基化與去甲基化在AD形成過程中可能起到了直接作用[42]。針對AD患者死后大腦中APOE基因DNA甲基化分析研究表明，AD患者腦中的非神經元細胞主要由神經膠質組成，AD患者腦中APOE基因DNA甲基化程度顯著降低[43]，說明APOE的異常去甲基化可能是影響AD風險的主要因素。在正常健康和AD患者腦組織中，HSPA8和HSPA9的啟動子DNA甲基化水平差異明顯，表明相關基因及其甲基化修飾是AD發病機制的一部分[44]。另外，DNA去甲基化過程的中間產物如5hmC及miRNA誘導的沉默復合體等標志物，對維持動物體神經細胞正常運行具有重要作用。理解對DNA去甲基化有關的表觀遺傳因素與非遺傳因素的相互作用，有助于對AD發病機制的理解，并有望用于研究新型診斷性生物標志物或藥物并投入使用。

3.3 心血管疾病

心血管疾病(Cardiovascular Diseases，CVD)是全球負擔最重的慢性疾病之一。根據2016年全球疾病負擔顯示，CVD所造成的居民死亡人數已超越癌癥，成為了全球居民死亡首位因素[45]。

冠心病是由多基因遺傳和環境誘發等因素共同作用產生的疾病，目前心血管領域研究的熱點在于對表觀遺傳修飾的研究，即環境與基因之間的相關作用可以通過表觀遺傳學中某些機理進行解釋，冠心病類疾病的產生與惡化與相關DNA的異常甲基化關系密切[46,47]。研究發現，相關基因中5hmC水平程度與低氧環境下血管生成密切相關，5hmC作為DNA去甲基化中間產物，根據其水平可活化凋亡基因和被抑制基因，基因中5hmC水平的下降則會導致相關基因缺乏保護，從而導致心腦血管疾病的發生[48]。相信隨著檢測技術的改進與相關研究的深入，5hmC有可能成為人類心血管疾病早期診斷與預后診斷的新的表觀遺傳標志。

PM2.5是大氣中重要的環境污染物，是造成心血管疾病的可控的環境危險因素。PM2.5進入人體后可通過影響機體DNA甲基化水平途徑影響CVD的發生[49]。在CVD病變出現前就有DNA甲基化的改變，因此DNA甲基化可為CVD臨床早期診斷提供依據[50]。PM2.5暴露量與特定基因位點甲基化與去甲基化的作用，主要影響參與人體系統炎癥因子反應、血管延舒收縮和凝血系統啟動活性等，這些功能的受損均與CVD的發病機理相關[49]。

3.4 塵肺病等肺纖維病變

塵肺病是以肺部纖維化病變為主要特征的疾病，主要發生于易長期吸入微粒粉塵的職業從業者中。在疾病發生過程中，細胞因子基因活性可通過DNA甲基化過程而被調節或改變，從而影響相關因子的轉錄成功率[51,52]。有研究對矽肺病病例血液樣本進行調查，發現其血液中O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶基因、死亡相關蛋白激酶基因等均產生甲基化失衡，表現出高甲基化狀態[51]。有學者通過對塵肺病患者相關基因表達及其甲基化狀態進行研究，研究發現基因啟動子可通過高甲基化進行基因沉默，使其喪失轉錄活性，同樣可通過去甲基化促進基因的表達，而相關從業者長期大量的稀土粉塵的吸入，會使其IFN-γ基因啟動子甲基化率高于正常人群，而IL-10基因啟動子去甲基化率高于正常人群。該研究表明，稀土粉塵的長期高攝入量對從業者肺部相關基因表達造成了明顯影響，DNA甲基化與去甲基化平衡被打破，造成相關基因啟動子失衡[53]。

3.5 進食障礙

進食障礙(Eating Disorders，ED)，作為人類精神疾病中死亡率最高的疾病之一，該疾病的產生現已被證明與表觀遺傳修飾具有深刻的聯系[8,54]。ED的產生目前已被發現與內穩態通路DNA異常甲基化有密切的聯系。神經性厭食癥(Anorexia Nervosa，AN)患者呈現整體水平DNA低甲基化。有研究對AN患者進行高通量DNA甲基化分析發現，無論是臨床急性發作的AN患者還是體質量正常的AN患者，其機體甲基化程度均異于正常人群對照組[55]。通過研究ED的整體甲基化模式，建立小鼠進食成癮行為模型，發現成癮樣小鼠前額皮質相同腦區蛋白表達上調，其基因啟動子DNA甲基化顯著降低[56]。

4 總結與展望

在植物體和動物體的生命活動過程中，作為DNA胞嘧啶甲基化沉默基因表達的逆過程，DNA去甲基化扮演著重要角色。目前對動植物DNA主動去甲基化已有一定的理論支持，在植物機體內，以ROS1/DME酶介導的堿基切除修復去甲基化過程已被證實，但哺乳動物中是否存在直接5mC去甲基化酶還尚未定論。

DNA 5mC甲基化異常及去甲基化異常均會對機體正常生命活動產生不利影響，與DNA甲基化相比，DNA去甲基化似乎是一個更為敏感的標志物，對DNA去甲基化功能的理解對于解釋在癌癥等疾病中觀察到的甲基化含量變化是必要的。通過對惡性腫瘤、阿爾茲海默癥、心血管疾病、肺纖維病變、進食障礙等進行的研究，均表明了DNA去甲基化在疾病臨床診斷和預后康復的巨大潛力。因此，研究DNA去甲基化及其對于生物體機理的改變，對于臨床醫學具有深遠的意義。

真核生物6mA修飾是近年研究的熱點。自2015年，發現果蠅、線蟲和綠藻基因組DNA中存在6mA修飾后[57,58]，引起了廣泛關注。但6mA是否存在于哺乳動物基因組中一直存在爭議[59]。目前已發現哺乳動物細胞內6mA可來源于聚合酶依賴的摻入[60]，而是否存在甲基化轉移酶介導的N6-腺嘌呤甲基化，以及6mA修飾在細胞中可能具有什么功能依然有待探索。