黃芩苷治療非酒精性脂肪性肝病研究進展

孫 中，袁曼玲，劉 帥，彭 沖，王 媛，王艷梅，艾 江

(1.牡丹江醫學院研究生院；2.牡丹江醫學院附屬紅旗醫院消化內科，黑龍江 牡丹江 157011；3.廈門市婦幼保健院，福建 廈門 361001)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種與基因、環境、代謝、應激等多因素相關的臨床病理綜合征，也是代謝綜合征(Metabolic Syndrome)的肝臟表現。世界范圍內，NAFLD 的發病率為9%～36%，在美國等發達國家，NAFLD 的發病率近5年內由15%上升至25%，且常與代謝性共病相關[1]。據報道，非酒精性脂肪肝在我國的發病率在15%～30%，并且呈患病率逐年增高、低齡化的趨勢[2]。隨著肥胖和糖尿病的發病率增加，NAFLD現已成為我國常見的慢性肝病之一,嚴重危害人民健康。黃芩苷(Baicalin, BA)是唇形科植物黃芩干燥根中含量最高的黃酮類化合物之一。黃芩在我國藥用歷史悠久,《神農本草經》中介紹其具有“諸熱黃膽，腸泄痢，逐水，下血閉，惡瘡疽蝕火瘍”功效。傳統醫學中主要用于治療濕溫、暑濕、胸悶嘔惡、濕熱痞滿、瀉痢、黃疸、肺熱咳嗽、高熱煩渴、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動不安。現代藥理學研究發現，黃芩苷具有抗炎、抗氧化以及抗脂質沉積、抗纖維化的作用。多項研究表明，肝細胞在脂肪變性基礎上進一步誘發炎性反應、氧化應激反應是NAFLD進展為肝纖維化、肝硬化發展的關鍵環節。近年來，越來越多的學者開始關注黃芩苷對 NAFLD 的治療作用。目前，部分細胞與動物的相關研究證實了黃芩苷治療 NAFLD取得顯著療效，但臨床研究證據不足，缺少臨床對照實驗研究。本文通過查閱近幾年相關文獻報道，圍繞黃芩苷在NAFLD疾病模型中的相關作用機制研究進展進行概述。

1 脂質代謝

肝臟參與脂質代謝的多個重要環節，包括脂肪酸的攝取與合成,脂質的加工、貯存、氧化分解及輸出等。NAFLD主要以肝細胞的脂肪變性和脂肪貯積為病理特征。“多重打擊”學說認為，脂肪細胞中游離脂肪酸(free fatty acids，FFAs)水平升高及FFAs 氧化水平降低，進而會引起肝細胞中脂肪過度積累，這是導致NAFLD形成的重要原因。BA是一種多酚類化合物，是從黃芩的根中分離出來的主要生物活性黃酮類化合物，被廣泛應用于中醫治療炎癥、高血壓、心血管疾病以及細菌和病毒感染。多項研究表明，黃芩提取物可顯著降低高脂飲食大鼠血漿總膽固醇和甘油三酯水平,BA還能降低人血漿甘油三酯水平，抑制脂代謝異常疾病進展。BA降低高脂飼料(High Fat Diet，HFD)喂養大鼠血脂的機制可能與腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-Activated Protein Kinase，AMPK)通路相關。AMPK是細胞和系統水平上脂質代謝的重要調節因子，肝臟AMPK功能障礙是遺傳性肥胖嚙齒動物、HFD的小鼠和大鼠中肝臟脂質積聚和高脂血癥伴肝臟脂肪變性的關鍵機制。研究觀察發現，在肝臟中表達構成活性(CA)-AMPKα1的轉基因小鼠的白色脂肪水平降低，并且對高脂肪飲食誘導的肥胖具有抵抗能力。AMPK激活劑二甲雙胍和噻唑烷二酮類已被證明能降低肝臟脂肪，改善脂肪肝疾病。

在使用BA干預的對照實驗中，研究者觀察到其可明顯降低HFD大鼠的體重、血漿中膽固醇的含量、自由脂肪酸的含量以及胰島素濃度，并能夠顯著降低肝臟脂肪沉積。Gao等[3]觀察了BA對HFD大鼠肝臟AMPK活化的影響，實驗通過磷酸化抗體免疫blots檢測AMPKα及其下游主要靶點乙酰輔酶a羧化酶(ACC)的磷酸化狀態來評估AMPK的激活情況，研究發現HFD抑制肝臟AMPKα磷酸化(激活)和ACC磷酸化，而BA可顯著恢復HFD抑制肝臟中AMPKα和ACC磷酸化水平，同時抑制肝臟SREBP-1c及其靶蛋白FAS mRNA基因表達，減少脂肪合成酶的表達降低脂肪生成。AMPK在調節能量代謝中主要受兩種上游激酶LKB1或Ca2+/鈣調蛋白依賴的蛋白激酶β(CaMKKβ)控制。Ying等[4]研究發現，在細胞中黃芩苷通過αthr172磷酸化及其下游靶點乙酰輔酶a羧化酶Ser-79位點磷酸化激活AMPK，使用抑制劑抑制CaMKKβ后，BA處理不再減少油酸引起的細胞內脂質積累。這一結果表明，黃芩苷可能通過CaMKKβ通路激活AMPK。此外，Dai等[5]通過定量化學蛋白質組學分析，發現黃芩苷是一種天然的肉堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)的變構激活劑，黃酮類化合物具有選擇性地直接激活肝臟CPT1，加速脂質進入線粒體氧化，改善飲食誘導的肥胖和肝脂肪變性及其他代謝紊亂，破壞CPT1上黃芩苷的預測結合位點，完全消除了黃酮類的有益作用。這一發現可能為肥胖和肝脂肪變性及其相關疾病治療找到了新的研究方向。

2 炎癥反應及相關信號通路調節

體內過量的FFA會從脂肪組織輸送到肝臟并儲存在肝內池，脂肪堆積會引起肝脂肪毒性，誘導肝細胞釋放大量促炎細胞因子，引發氧化應激和肝星狀細胞活化，最終導致肝炎性損傷。NAFLD相關炎癥的發生涉及各種免疫細胞、信號通路的相互作用，是一個復雜的過程。研究發現，中性粒細胞(neutrophils)和巨噬細胞(macrophages)與 NAFLD的發病機制有關。巨噬細胞和中性粒細胞均能釋放炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6等，加重肝細胞的損傷和壞死。TNF-α是一種參與肥胖、IR、高脂血脂及 NAFLD等代謝性疾病的重要的細胞因子，是肝臟損傷過程中最早出現的細胞因子，并且TNF-α能引起 IL-1β、IL-6 的釋放，三者一起介導炎癥反應，形成級聯放大反應。在大鼠肝臟急性損傷模型研究中發現，BA能夠減少肝臟組織中的TNFα，NF-κB等的水平以及血漿中的TNFα、IFNγ，IL-6的水平，減輕肝臟炎癥損傷。袁穎琳[6]通過對多種炎癥介質 mRNAB 表達水平進行檢測發現，BA可以不同程度降低NAFLD 肝臟中細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、粘附分子(ICAM、ECAM、ELAM)和趨化因子(CCL2、CXCL2)的 mRNA表達。Zhang等[7]發現BA可明顯使血清TNF-α，IL-1β和MCP-1產生減少，巨噬細胞流入和核因子-κB激活抑制，從而抑制蛋氨酸膽堿缺乏飲食誘導的肝炎癥狀。

肝細胞中脂質的積累損傷肝細胞產生脂毒性可激活Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)，TLR4 介導的多條信號通路在NAFLD誘導的炎癥反應中起著關鍵的作用。TLR4被激活后，MyD88 被募集增多，進一步誘導細胞核-κB(Nuclearfactor-κB，NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)的激活轉錄，促進 TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性因子的表達和炎癥細胞的浸潤，加重肝損傷。Kiziltas等[8]在研究中證實，NAFLD 患者和動物模型中TLR4 表達均不同程度上調。Csak 等[9]發現和正常小鼠相比，TLR4 敲除可以減輕膽堿缺乏飼料(Methionine and Cystine deficient Diet,MCD)誘導小鼠的脂肪變性和纖維化。Jin等[10]使用黃芩苷和黃芩苷納米脂質體干預可明顯降低MCD誘導的NAFLD小鼠血漿轉氨酶、肝細胞凋亡、肝臟脂質積累、肝纖維化、中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，進一步分析發現BA通過抑制MCD小鼠toll樣受體4(TLR4)信號上調和炎癥介質的產生發揮作用。

3 氧化應激

體內活性物質產生增多和抗氧化應激防御的減弱，是NAFLD發生的重要原因。脂質代謝紊亂影響活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的產生，特別是脂肪酸氧化可能在NAFLD中產生更多的ROS。相關研究表明，抗氧化因子(如輔酶泛醌、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽等)的減少與脂肪性肝病的嚴重程度呈正相關。

黃酮是存在于自然界的天然抗氧化劑，其可通過多種途徑發揮抗氧化能力。分子研究表明黃芩苷可顯著降低誘導型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)和環氧化酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的mRNA表達[11],降低細胞色素C的活性減少活性氧類物質產生，同時激活mRNA和提高蛋白質水平來增強Nrf2介導的抗氧化系統，增加共激活因子-1α，HO-1，GST和NQO1表達，從而改善了NAFLD病情。在NASH大鼠模型中發現，BA 還能通過減輕氧化應激反應來改善有毒物質引起的肝臟細胞腫脹、白細胞浸潤以及肝細胞壞死，并且能夠降低有毒物質引起的血漿ALT、LDH的上升，提高谷胱甘肽的水平，增加GSH、SOD 酶的活性，減少TNFα、IL-1β、IL-6炎性因子的產生，發揮其抗炎作用。Ai 等[12]發現黃芩苷可以減少氧化應激情況下脂肪酸結合蛋白的形成，增強 L-FABP 的表達以及相關抗氧化酶SOD、GSH等的表達，并能夠保護肝細胞免于受到氧化應激的攻擊。

4 抑制肝纖維過程

NAFLD在脂肪性肝炎階段，除有氣球樣變、點灶狀壞死等炎性改變外，已經有明顯肝纖維化改變。肝纖維化是炎癥及氧化應激損傷后，肝臟產生的纖維結締組織沉積的一種自身的修復反應，表現為細胞外基質(Extracellular Matrix,ECM)增多,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原過度增生沉積的結果，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)活化、橫向分化為肌纖維細胞被認為是肝纖維化發生發展的中心環節。HSC 誘導激活、趨化和增殖，促纖維化細胞因子分泌及膠原合成增加，致使ECM 增生與降解失衡，引起肝內纖維結締組織異常沉積，最終導致肝臟結構破壞、纖維化病變和肝功能異常。體外實驗證實BA具有抑制大鼠 HSC活化增殖，促進 HSCs 凋亡，抑制 HSCs 的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達的作用。研究發現，BA能夠抑制大鼠NASH動物模型組中TGF-β1、Col1A1產生和抑制a-SMA、I型膠原的表達，此外，BA可增加miR-3595的表達，負調控長鏈脂肪酸CoA連接酶4(ACSL4)，ACSL4以BA劑量依賴性的方式發揮抗纖維化作用。有研究表明，亮氨酸減少能夠誘導敲除基因Gcn2的小鼠產生脂肪肝[13],黃芩苷能回調甲基丙二酸，顯著提高左旋亮氨酸含量而參與亮氨酸代謝，改善肝纖維化[14]。這些研究表明 BA可以減輕NAFLD的炎癥和纖維化狀態。

5 腸道菌群

腸道菌群失調在人類肝病發病中起著重要作用，尤其是NAFLD及其相關的代謝紊亂。腸道菌群相關代謝物可通過腸-肝軸轉運到肝臟，有害細菌及其代謝產物進入血液循環可造成菌血癥或其他組織的損傷。研究發現，50%非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)病人出現小腸細菌過度生長,晚期肝纖維化患者糞便中變形桿菌水平較高，而早期肝纖維化患者的厚壁菌門水平較高[15],Le Roy等[16]將高脂飲食誘導的 NAFLD 小鼠的腸道菌群移植入無菌小鼠體內，發現無菌小鼠發生 NAFLD。Turnbaugh等[17]發現脂肪肝小鼠中腸道微生物碳水化合物代謝基因富集，導致盲腸短鏈脂肪酸濃度升高，糞便中能量降低，肝的能量負荷增加。腸道菌群改變可能通過增加腸道能量攝取，減少能量丟失來促進NAFLD的發生。

近年來研究者發現，BA能通過調節腸道革蘭氏陰性菌與陽性菌的比例，減少內毒素的生成入血以及炎性因子的分泌，從而減輕代謝性炎癥，對NAFLD起到治療作用[18]。此外，黃芩提取物增加大腸中總厭氧菌及乳酸菌的豐度，并促進丁酸鹽的產生[19]，BA能夠穩定腸道群落結構,使益菌數量增多,條件致病菌腸球菌數量略減[20]。

6 總結和展望

上述大量與脂質蓄積、脂代謝異常相關的動物、細胞模型的研究證據表明，BA確有調脂、抗炎、抗氧化、抗纖維化、降低肝細胞凋亡、調節腸道菌群等功能。但由于目前BA及相關藥物應用于臨床研究資料較少，其對NAFLD 患者療效的臨床療效缺乏實驗證據。伴隨NAFLD患者日益增多，在天然藥物中尋找安全有效的降脂、抗炎、抗氧化新型藥物具有重要探索意義。BA具有良好的抗炎、抗氧化作用，對防治并發癥也具有一定療效，相信隨著實驗的深入研究和臨床的積極應用，BA有望成為 NAFLD 及其相關疾病的潛在治療藥物之一。