單核細胞增生李斯特菌生物學毒理特性及防控方法研究進展

關紅陽，王 丹，馬 越，孫也婷，王宇濱，趙曉燕，梁 浩

（1.北京市農林科學院蔬菜研究中心，北京市果蔬農產品保鮮與加工重點實驗室，農業部蔬菜產后處理重點實驗室，北京 100097；2.沈陽農業大學，遼寧 沈陽 110866；3.龍大食品集團有限公司，山東 萊陽 265231）

0 引言

單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）屬于李斯特菌屬。目前，國際上公認的李斯特菌屬共有7 個菌種。單核細胞增生李斯特菌是唯一能夠引起人類疾病的菌種。單核增生李斯特菌是一種細菌性食源性病原體，與世界各地的散發病例、爆發和食品召回有關。現代的食物系統多樣而復雜，食品、加工供應品和原料的全球流動，加上單核細胞增生李斯特菌的持續存在和繁殖能力，促進了受污染產品的跨境傳播，往往導致大規模召回。食品召回不僅是一個公共健康問題，還會造成重大的經濟損失。與其他食源性疾病相比，單核增生李斯特菌的住院率和致死率較高。由于單核細胞增生李斯特菌具有在冷藏溫度下生長和存活的能力，即使少量的細菌也是潛在的食品安全問題。因此，在食品衛生微生物檢驗中，必須引起人們的高度重視。

1 生物學特性

1.1 形態

單核細胞增生李斯特菌簡稱單增李斯特菌，為革蘭氏陽性菌，屬厚壁菌門。其大小約為0.5 μm×1.0 μm ～0.5 μm×2.0 μm，直或稍彎曲狀，兩端鈍圓，呈桿狀和球桿狀。單增李斯特菌可以在營養豐富的條件下形成莢膜，單增李斯特菌在22～25 ℃的環境中可形成4 根鞭毛，運動較活潑；而在32 ℃條件下僅形成一根鞭毛，運動較緩慢[1]。

1.2 培養特性

單增李斯特菌為需氧或兼性厭氧菌；單增李斯特菌對熱的抵抗力較弱，在60 ℃下30 min 或在80 ℃下1 min 即可全部滅活[1]；而該菌對低溫有較強的耐受性，能在冷藏條件下生長；其生長范圍為1～45 ℃（也有報道在0 ℃能緩慢生長），最適培養溫度為35～37 ℃；單增李斯特菌在pH 值中性至弱堿性的條件下生長良好；其對NaCl 的抵抗力較強，在6.5%NaCl 肉湯中可以較好地生長[2]。

單增李斯特菌在不同培養基上的生長形態不同。在普通瓊脂平板上，初始菌落很小，半透明，呈露滴狀，但隨著菌落的增大，變得不透明。在血瓊脂平板上，菌落通常也不大，圓潤，灰白色，穿刺接種血平板培養一段時間后可形成窄小的β - 溶血環，溶血環的直徑約為3 mm。在TSAYE 平板和MMA 平板上，菌落呈藍色、灰色或藍灰色。單增李斯特菌在麥康凱瓊脂培養基（MAC）、伊紅美藍瓊脂培養基（EMB） 和沙門志賀菌屬瓊脂培養基（SS） 上不生長[1]。

2 流行病學

2.1 污染源

單增李斯特菌是一種無處不在的細菌，能夠在環境中存活和生長，并容易定殖在廣泛的基質，如土壤、污水、人和動物糞便及多種食物。人類和動物可能會食入單增李斯特菌，并通過口腔- 糞便的途徑進行傳播。據文獻報道，健康人類糞便中單增李斯特菌的攜帶率為0.65%～16.0%，并且約70%的人可在短期內攜帶該菌。單增李斯特菌既可以隨食品原料進入食品加工廠，也可以由排泄物或灰塵經工作人員帶入，附著在食品加工設備上并在加工場所存活，從而污染食品[3]。單增李斯特菌能夠附著在各種食品接觸表面，如不銹鋼和聚苯乙烯。由于單增李斯特菌在食品加工過程中具有抵抗不利條件的能力（如高溫和低溫、氣調，甚至是食品加工環境中的設施），表明其可能在食品加工設施中持續數月甚至數年，在加工和后加工過程中單增李斯特菌可能會持續污染食品。迄今為止，科學研究的重點集中在附著潛力、生物膜形成能力，以及對干燥、酸和熱的耐受性、對增加的消毒劑亞致死濃度的耐受性和對致死濃度的耐受性。

2.2 污染情況

單增李斯特菌通常是從加工即食、冷藏肉類和奶制品中發現和分離出來的。許多文獻研究表明，在不同種類的市售食品中可檢測出單增李斯特菌。在食品中，受污染的肉制品被認為是單增李斯特菌感染的主要來源。尤其是受污染的即食肉制品，因為其無需進一步消毒處理即可食用。梁文革等人[4]對寶雞市13 類共2 357 份市售食品進行分離和鑒定。共計從200 份食品中檢測出單增李斯特菌，檢出率為8.49%。結果顯示，寶雞市市售食品單增李斯特菌的污染率從高到低分別為調理肉制品44.44%，冷凍肉糜制品36.36%，涼拌菜20.36%，生畜肉19.04%，生禽肉17.24%，以肉制品和涼拌菜中單增李斯特菌的污染率較高。楊修軍等人[5]對吉林省市售食品進行檢測，5 093 件11 類食品中共檢出單增李斯特菌294 株，總檢出率為5.77%。其中，肉與肉制品的單增李斯特菌檢出率最高，達到了12.43%。杜偉靜等人[6]檢測北京市東城區市售食品265 件樣品，檢出單增李斯特菌17 株，全年檢出率為6.42%，污染最嚴重的是肉與肉制品，檢出率為15.56%。劉海霞等人[7]檢測云南省1 465 份熟肉制品中的單增李斯特菌，檢出率為2.18%。生肉中的單增李斯特菌主要是來源于環境中單增李斯特菌的傳播。生肉制品可能在屠宰、包裝、運輸和分銷過程中受到單增李斯特菌的污染。而熟肉制品多數由小作坊生產加工制成，對原材料和成品的加工過程缺乏衛生質量控制，從而導致帶菌率和污染率較高。再者由于盛放熟肉的器具多為開放或半開放式，極易造成加工后二次污染。生熟食使用同一個案板，也可能會導致單增李斯特菌的交叉感染，所以要特別注意即食肉制品的衛生安全。奶制品中單增李斯特菌的檢出率也較高，Barría C 等人[8]對來自39 家智利奶酪生產商的546 份樣本（奶酪樣本468 份，牛奶樣本78 份） 進行檢驗，其中來自5 個生產商（12.8%） 的19 種奶酪（4.1%） 中發現了單增李斯特菌。近年來，越來越多的報告顯示從市場或餐館的新鮮農產品（如卷心菜、玉米、胡蘿卜、生菜、黃瓜、歐芹和沙拉蔬菜） 中分離出了單增李斯特菌[9]。2008 年，Anderson A S 等人[10]評估了圣保羅市售的512 包即食蔬菜中單增李斯特菌的患病率和數量。3.1%的樣品中存在單增李斯特菌污染。Szymczak B 等人[11]研究表明，生長在自然施肥土壤中的5%的歐芹對單增李斯特菌呈陽性反應。Seo Y H等人[12]對韓國首爾的一家百貨商店、一家當地超市和一家餐館的蔬菜進行致病菌檢測，總共收集了345份經過最少加工的蔬菜樣本。結果顯示，0.3%的豆芽樣品檢測到單增李斯特菌。Uzeh R E 等人[13]測試了許多沙拉類蔬菜（生菜、卷心菜、胡蘿卜和黃瓜），其中白菜和生菜樣品表現出陽性反應。食品中單增李斯特菌污染情況不容樂觀，檢出率較高，特別是肉制品、奶制品和新鮮農產品，存在一定程度的安全隱患，對這幾類食品的生產、運輸和銷售環節要加強監管，預防食品安全事件發生。

2.3 致病性

單增李斯特菌在環境中具有較強的生存適應能力，在土壤中過著腐生生物的生活，但當它進入人類或動物細胞時，會轉變成具有致病性的生物[14]。自從20 世紀20 年代，人類和動物李氏桿菌病首次被認為是由細菌引起的感染以來，單增李斯特菌與1981 年食源性疾病爆發的聯系促進了人們對單增李斯特菌的研究，確定該有機體的普遍存在及其傳播方法[15]。人類感染單增李斯特菌主要通過接觸被感染的動物，也可能由于誤食被污染的食品。食品的污染可能發生在食物鏈的不同環節，從生產、加工到包裝和分銷，從而引發食品變質，改變最初食品的品質，使消費者不滿意，甚至危及生命。此外，單增李斯特菌也可以通過人類的眼睛及破損的皮膚黏膜進入人體而造成感染。單增李斯特菌可導致2 種類型的疾病癥狀。其中，一種為侵襲性李氏桿菌病，該菌通常會感染身體的無菌部位，如肝臟、脾臟、腦脊髓液和血液[16]。人類感染單增李斯特菌后是否發病，主要與菌的毒力有關，也與宿主的年齡、免疫狀態相聯系。因此，高危人群為孕婦、新生兒及老年人，免疫功能低下者也易被單增李斯特菌感染。對于孕婦，主要癥狀是發燒、腹瀉、流產或死產，約17%的李氏桿菌病病例發生在孕婦中[17]。而新生兒感染單增李斯特菌可引起肺炎、腦膜炎和敗血癥[18]。而在免疫能力強的健康成人中，感染單增李斯特菌的主要癥狀為腹瀉和發燒[19]。單增李斯特菌也能引起非侵襲性疾病，通常為熱性胃腸炎或非侵襲性胃腸炎，與由受污染的熟食肉類、巧克力牛奶、奶酪、熏魚和玉米引起的爆發有關。由單增李斯特菌引起感染的李氏桿菌病死亡率極高，可達20%～30%。2010 年，德克薩斯州衛生服務部（DSHS） 報告了一起與切碎的芹菜有關的李氏桿菌病爆發，10 名年齡在56～93 歲的感染患者中，有5 名患者在3 個月內死亡[20]。2011 年，美國多州爆發李氏桿菌病，多人食入了單增李斯特菌污染的哈密瓜，共有147 人感染，導致33 人死亡，1 人流產[21]。同年，美國19 個州爆發了一次與生菜相關的疫情。在這次疫情中，84 人患病，其中15 人死亡。2014 年，加州爆發了一場與蘋果污染有關的單增李斯特菌疫情。總共有35 人，包括11 名孕婦，其中7 人死亡[22]。

3 主要毒力因子

單增李斯特菌為侵襲性胞內寄生菌，可穿越宿主三道緊密的屏障（腸屏障、血腦屏障和胎盤屏障）[23]。單增李斯特菌在毒力因子的作用下進入宿主細胞，然后通過血液循環和淋巴循環系統到達宿主的各組織器官，最終引起全身感染[24]。其感染過程包括細菌內化、逃避液泡、細胞吞噬、肌動纖維聚集和細胞間傳播等階段[25]。單增李斯特菌感染宿主過程中的每一步都需要由特定的毒力因子調控[26]。毒力因子的編碼基因常聚類于毒力島。單增李斯特菌主要有2 個毒力島，分別為毒力島1（LIP-1） 和毒力島2（LIP-2）[27]。毒力島1（LIP-1） 與單增李斯特菌的胞內感染有關，由6 個主要毒力因子的編碼基因組成，包括prfA、plcA、plcB、hly、actA、mpl。毒力島2（LIP-2） 與單增李斯特菌的黏附和侵襲有關。位于該毒力島上的基因是單增李斯特菌所特有的一個多基因家族，包括inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlE、inlF、inlG、inlH。這些毒力基因編碼的與單增李斯特菌黏附、侵染相關的主要毒力因子包括InlA、InlB、LLO、ActA 和p60 等[28]。

3.1 InlA 和InlB

內化素是inl 編碼的內化素家族的一組蛋白質，內化蛋白是一種參與進入上皮細胞的LPXTG 蛋白，其特征是富含亮氨酸的重復序列（LRRs）。內化蛋白在腸屏障的穿越中起關鍵作用，包括InlA、InlB、InlC、InlC2、InlD、InlE、InlF、InlG、InlH。內化蛋白A（InlA） 和內化蛋白B（InlB） 是僅在單增生斯特菌中發現的2 種主要表面蛋白，也是最早確定的介導細菌侵入宿主細胞的毒力因子，受轉錄調控因子PrfA 調節[24]。最近研究表明，InlA 的轉錄還受Sigma 因子調節，進而影響單增李斯特菌對宿主細胞的侵襲力和致病性[29]。InlA 和InlB 誘導非吞噬哺乳動物細胞的吞噬作用。InlA 為單增李斯特菌穿越腸道上皮和胎盤屏障所必需的因子，由800 個氨基酸組成，其氨基端具有亮氨酸重復（LRR） 區域，中間重復區（IR） 和B 重復區，LRR 與IR 區域是單增李斯特菌入侵人上皮細胞所必需的[24]。InlA 羧基端具有Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG)基元，該基元以共價鍵的方式連接肽聚糖，在單增李斯特菌穿越腸道屏障中發揮重要作用[28]。InlA 在臨床菌株中的表達率（96%） 遠高于從食品中分離的菌株（65%），表明InlA 對于人類李氏桿菌病的發病機理是至關重要的，因此可以作為食品安全評估項目中毒性的標志。InlB是一種既作為生長因子又作為侵襲因子的GW 蛋白。InlB 由630 個氨基酸組成，是內化素家族的另一成員，與InlA 位于相同的操縱子上。InlB 參與李斯特菌進入廣泛的細胞系，包括肝細胞和非上皮細胞。

其氨基端結構域呈信號序列，依次是7 個亮氨酸重復（LRR） 區域，1 個中間重復區（IR），1 個B 重復區。羧基端結構域為3 個串聯重復序列。InlB 的氨基端和羧基端結構域在細胞侵襲過程中起協同作用。還有研究表明，InlA 和InlB 在單增李斯特菌黏附在玻璃表面的過程中起重要作用。

3.2 李斯特菌溶血素O（LLO）

李斯特菌溶血素O（Listeriolysion O，LLO） 由毒力基因hly 編碼形成。LLO 作為一種孔形成毒素，可溶解大多數哺乳動物的紅細胞。LLO 通過溶解細胞并吞噬細胞膜使李斯特菌離開吞噬體，促進菌體進入細胞液，從而在機體內進行增殖，由此被認為是李斯特菌的主要致病因子[30]。LLO 的缺失型突變體無法進入宿主細胞質中，對宿主無毒力，導致細菌毒力的全部喪失[25]。LLO 是一個多功能毒力因子，在LLO 刺激下已經檢測到許多細胞反應：細胞增殖、黏膜細胞外滲作用、巨噬細胞中白細胞介素-1 的分泌、宮頸癌細胞中有絲分裂原活化蛋白激酶的活化，細胞黏附因子在感染的內皮細胞上的表達。

3.3 ActA

ActA 是肌動蛋白聚集因子，由毒力基因ActA 編碼合成。單增李斯特菌借助細菌表面蛋白ActA 聚集宿主肌動蛋白絲實現在宿主細胞的細胞質內運動。ActA 使肌動蛋白聚合，從而促進其胞內運動和細胞間擴散，對細菌聚集和生物膜的形成至關重要，ActA 可跨越細菌膜和肽聚糖細胞壁。ActA 參與單增李斯特菌的細胞黏附和侵襲過程，也與單增李斯特菌被宿主細胞內化有關[25]。單增李斯特菌能夠在細胞內選擇性地增加基因的表達，如在哺乳動物細胞的細胞質中ActA 的表達量能夠增加226 倍以上，而hly 只能增加20 倍。ActA 缺失型突變體由于硫酸乙酰肝素識別功能的改變，使其在中國倉鼠卵巢上皮細胞和IC-21 鼠巨噬細胞的黏附和侵襲方面受損嚴重[28]。

3.4 p60

單增李斯特菌的主要胞外蛋白p60 是一種能夠水解細菌細胞壁肽聚糖的自溶素，由iap 基因編碼形成，是單增李斯特菌致病所必需的。p60 包含一個經典的氨基末端信號序列，其后是功能相關性尚不明確的SH3 區，p60 的中心部分為蘇氨酸- 天冬酰胺重復區。羧基末端為一個細胞壁水解酶活性區[24]，p60 參與單增李斯特菌侵襲吞噬細胞的過程，是單增李斯特菌在細胞分裂過程中所必需具備的。由于ActA 在Δp60 突變菌株中的分布不均勻，導致了肌動蛋白尾形成的缺陷，細胞內運動和細胞間擴散急劇減少。盡管與野生型菌株相比，這種Δp60 突變體菌株在小鼠成纖維細胞和人上皮細胞中的侵襲性僅略微減弱，但在小鼠中卻顯著降低[31]。

4 控制方法

4.1 輻照技術

輻照是一種非熱技術，是指應用小劑量的電離輻射對食品表面進行殺蟲、滅菌，可作為一種凈化技術，以提高食品的安全性和延長食品的保質期。紫外光、γ、X 和α 射線及電子束是工業中最常用的輻照技術。輻照在食品工業中的應用非常廣泛，最常見的應用包括抑制發芽、消滅昆蟲和寄生蟲、殺滅非孢子形成的病原體。輻照技術不僅操作方便，不會造成化學物質殘留，并且能較好地保持食品的原有風味，從而達到延長貨架期的目的。輻照滅活細菌的機制主要是通過破壞細菌的脫氧核糖核酸來防止細菌繁殖。輻照技術在許多研究中得到了較好的結果。王少丹等人[32]研究了不同劑量的電子束處理及電子束分別與酸化亞氯酸鈉（ASC）、檸檬酸（C）的聯合處理對鮮切青椒表面食源性致病菌的殺滅效果。結果表明，酸化亞氯酸鈉（ASC） 結合1 kGy 輻照處理在不影響鮮切青椒品質的同時，能夠有效地殺滅鮮切青椒表面的單增李斯特菌。付萍等人[33]對真空包裝的烤鴨、燒雞和熟肉制品進行了殺滅單增李斯特菌的輻照研究，結果顯示2.5 kGy60CO-γ 射線輻照處理可有效地殺滅全部樣品中的單增李斯特菌。輻照處理能夠有效提高食品的食用安全性，殺滅食品表面致病菌，降低食源性疾病發生的風險。

4.2 化學抑制劑

二氧化氯（ClO2） 是一種應用在果蔬加工生產中高效的果蔬化學殺菌劑和食品保鮮劑。ClO2處理后無殘留毒性且成本低，不會影響果蔬品質。ClO2可以防止乙烯的生成，殺滅果蔬表面的致病菌，從而達到長期保鮮的目的，延長果蔬的貨架期。氣體ClO2對蘋果表面致病菌有較好的殺滅效果。在25 ℃條件下，氣體ClO2的濃度為6 mg/L，殺菌5 min，對單增李斯特菌的殺菌率達到99.99%[34]。D - 色氨酸也是一種細菌生長的抑制劑。Chen Jian等人[35]研究D- 色氨酸對單增李斯特菌嗜冷性生長的影響。結果表明，D- 色氨酸在冷藏溫度下顯著減弱了單增李斯特菌的生長。

4.3 天然抗菌劑

乳酸菌（LAB） 是一種天然抗菌劑，能夠發揮一定的抗菌效果，主要是由于其能夠降低pH 值、競爭營養素、產生H2O2及抗菌化合物（如細菌素）。Morandi S 等人[36]研究發現2 種乳酸菌、乳酸和乳酸鈉（LASL） 的組合可有效抑制分離自奶酪的單增李斯特菌。Hossain M I 等人[37]研究了從泡菜中分離出的乳酸菌對生菜、不銹鋼表面和MBECTM生物膜裝置上的單增李斯特菌生物膜的抑制作用。結果顯示，不銹鋼、生菜、MBECTM生物膜裝置上的單增李斯特菌生物膜細胞分別減少2.17 log CFU/cm2，1.62 log CFU/cm2，1.09 log CFU/peg。Allende A 等人[38]用乳酸菌產生的細菌素作為新鮮切割卷心生菜的化學消毒的替代品。與對照相比減少了1.0～1.5 logs 的單增李斯特菌。Ramos B等人[39]對戊糖片球菌DT016 和片球菌素DT016溶液在貯藏期間抑制蔬菜中單增李斯特菌的潛力進行了評價。結果顯示，蔬菜中的病原體數量在整個貯藏期間顯著降低。之前的文獻研究表明含有乳酸乳球菌發酵物的乳酸鏈球菌素為控制即食食品上的單增李斯特菌提供了一種簡單有效的方法[40]。Kang J H 等人[41]研究諾麗果提取物（NFE） 對單增李斯特菌的抑制效果。結果顯示，NFE 制劑對單增李斯特菌具有良好的抗菌活性。精油類物質也是天然抗菌劑。丁香精油是典型的精油類抑菌劑，其主要成分為丁香酚，具有較強的殺蟲、抑菌和防腐保鮮作用。0.05%的丁香精油在8 h 內能清除99.99%的單增李斯特菌[42]。牛至精油和檸檬酸單獨使用或組合使用均可顯著減少滅活單增李斯特菌的時間，從而達到較好的效果。通過添加天然抗菌劑可以提高真空烹調魚的安全性[43]。已有文獻表明，氣態柑橘葉精油和麝香草酚等精油類物質對單增李斯特菌具有抑制作用[44]。

4.4 復合抑制劑

越來越多的文獻研究了復合抑菌劑對單增李斯特菌的抑菌作用。潘利華等人[45]研究Nisin、ε - 聚賴氨酸、曲酸三種抑菌劑的聯合使用對單增李斯特菌的抑制效果，當三者質量濃度分別為184.6 μg/mL，20.5 μg/mL，4.37 mg/mL 時對單增李斯特菌的抑制作用最佳。姜晨等人[46]研究復配抑菌劑對三文魚中單增李斯特菌的抑制效果。結果表明，甘氨酸、乙酸鈉、溶菌酶的質量濃度分別為6.4，4.9，0.6 g/L 的復合保鮮劑的抑菌效果最佳，抑菌率為80.00%±0.23%。

4.5 氣調包裝

氣 調 包 裝 （Modified atmosphere packaging，MAP） 是指用在食物儲存過程中，改變食品周圍氣體的組成，包括N2、CO2和O2，可以減少食品生理變化、延緩食品的氧化反應速度、抑制微生物的生長，從而達到延長產品貨架期的目的。氣調包裝對不同蔬菜中單增李斯特菌的抑制情況不同。使用3%O2+5% CO2進行氣調包裝，貯藏后發現單增李斯特菌能在黃瓜上較好地生長，而在生菜和甜椒上數量有所下降[47]。氣調包裝已被廣泛并成功地用于與冷藏相結合，以保持安全性并延長鮮切水果和蔬菜的貨架期。Carrasco E 等人[48]研究了氣調包裝在抑制單增李斯特菌時與貯藏溫度的協同作用。結果表明，4.65%～6.20% CO2+ 2.1%～4.3% O2氣調包裝鮮切生菜，分別儲存在13 ℃和5 ℃條件下，單增李斯特菌最大生長速率分別為0.019，0.013 log/h，到14 d 時其數量分別為4.85，2.66 CFU/g，在較低溫度下可以降低單增李斯特菌的生長速率。氣調包裝技術具有安全且無污染的特點。適當的氣調包裝處理可以有效地控制食品上致病菌的生長、保持食品的品質、延長食品的保質期。