冰凍組織樣本病理質控在轉化研究中的應用價值

王燦銘，張慧萍，黃旻然，吳映雪，泮曉丹，胡錦林，應莉莎，蘇丹

在精準醫學時代，隨著轉化醫學研究的快速發展，組織樣本的需求日益增長。雖然甲醛固定的石蠟包埋組織能解決部分研究的需求，但在大多數情況下，冷凍組織更受研究者的青睞，尤其是保存完好及高質量的樣本，可確保下游實驗的順利進行和結果的準確性。通常，研究者對冰凍樣本的核酸質量和濃度比較關注，是下游分子生物實驗前的常規檢測[1]，但冰凍樣本病理質控常被忽略，如病理診斷的再復核及腫瘤細胞含量等。有研究表明，10%的冷凍組織樣本不適合下游分子檢測，主要原因包括取材或診斷的不準確可導致研究結果偏倚[2]。冰凍組織樣本病理質控在轉化研究中扮演著至關重要的作用。本研究對93 例非小細胞肺癌共848 份組織樣本進行冰凍染色、病理診斷復核和腫瘤細胞含量評估。此外，對部分組織DNA 及RNA濃度與質量進行分析，為下游RNA測序和基因組測序的順利進行和結果分析及解讀奠定基礎。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 組織樣本 選取中國科學院大學附屬腫瘤醫院生物樣本庫2008 年4 月至2015 年7 月在－80 ℃低溫冰箱保存的非小細胞肺癌樣本93 例，其中鱗癌65例，腺癌28 例；手術時年齡44 ～77 歲，平均（63.4±7.3）歲；均為男性。根據生物樣本庫的樣本庫存情況，每個病例取腫瘤組織、癌旁組織（離腫瘤組織1 ～1.5 cm處）和遠離腫瘤的正常組織（離腫瘤組織5 cm以外或更遠處）各1 ～4 份，共計組織樣本848 份。其中腫瘤組織315 份，癌旁組織204 份，正常組織329 份。所有樣本均為中國科學院大學附屬腫瘤醫院手術樣本，標本離體后30 min 內由生物樣本庫專職人員取材，分裝在有RNA 保存液的冷凍管后放入液氮中臨時保存，后轉入－80 ℃低溫冰箱中保存。

1.2 實驗設備及材料 三洋冰箱、賽默飛NX50 冷凍切片機、OCT包埋劑、Nano Drop 2000 分光光度計、Agilent2100 生物分析儀及核酸提取試劑盒等。

1.3 組織樣本病理形態學評估

1.3.1 冷凍切片的制作 組織樣本通過冷凍切片機制作冷凍切片，制片前機器設備去除RNA對樣本的影響，包括冷凍切片機的消毒清洗；制片前先將冷凍切片機斷電化霜清洗，清洗干凈后箱體內擦焦炭酸二乙酯（DEPC）水，一次性切片刀在DEPC 水中浸泡10 min；冷凍切片機箱體溫度預先設置－30 ℃。制片時打開速凍臺制冷，切片用力均勻，防卷板調整至合適位置；每切一個樣本換一把新刀，同時將切片刀座、防卷板等部件用無水酒精擦拭，避免污染；待切樣本在干冰中臨時保存，切片時直接從干冰中拿取；在冷樣本托上用適量OCT 包埋劑將組織包埋好，壓上冷凍錘放置于速凍臺至組織完全冷凍；癌組織切片厚度為5 m，正常組織可適當加厚至6 m；勻速切片后經甲醇固定，進行HE 染色，封固；冰剩組織去除OCT包埋劑后放入RNA保存液中低溫保存，用于下游實驗。

1.3.2 鏡下形態學觀察 冷凍切片制作完成后由高年資病理醫師鏡下閱片，診斷切片與原病理結果是否一致，并計算腫瘤組織樣本中腫瘤細胞所占的比例。

1.4 RNA 的提取及質控

1.4.1 組織樣本總RNA提取方法（1）組織置于離心管后在液氮下研磨成粉，取少量加至有1 ml Trizol 的1.5 ml 離心管中，充分混合后于4 ℃，12 000 r/min離心15 min。（2）取上清移至新1.5 ml離心管中，加入200 l氯仿，劇烈震蕩直至呈乳白色，于4 ℃，12 000 r/min 離心15 min。（3）取上清移至新1.5 ml 離心管中，加入500 l 異丙醇，輕輕顛倒10 次，冰上放置20 min，于4 ℃，12 000 r/min 離心15 min。（4）棄上清，加入1 ml 75%乙醇（用DEPC水現配現用），于4℃，12000r/min離心5 min，重復此步驟一次。（5）棄上清后，室溫干燥5 ～7 min。（6）加入20～30 l 的DEPC 水溶解沉淀65 ℃溶解，－20 ℃保存。

1.4.2 RNA 純度和完整性檢測 取2 l提取好的RNA溶液，利用分光光度計檢測其濃度和純度，通過OD260/280 判斷RNA 純度。利用Agilent2100 生物分析儀測量RNA 的完整性指數（RIN）。

1.5 DNA 的提取及質控

1.5.1 DNA提取方法（1）冷凍樣本加入10 倍體積的組織保護液，置于4 ℃中解凍。（2）往20 ～60 mg 組織樣本中加入1 ml 0.9%氯化鈉注射液，振蕩混勻，12 000 r/min 離心2 min，小心去除上清，加入180 l Buffer DTL，將組織處理為勻漿。（3）加入20 l Proteinase K Solution，振蕩混勻，56 ℃消化至獲得較清透的組織溶解液。（4）取出樣品管，用掌式離心機離心5 ～10 s。（5）加入200 l BufferDTB和200 l無水乙醇，振蕩混勻后離心5 ～10s。（6）將全部液體轉移至DNA 吸附柱中，8 000 r/min 離心1 min，倒掉收集管中的液體。（7）往DNA 吸附柱中加入600 l Buffer DW1，8 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的液體。（8）往DNA 吸附柱中加入600 l Buffer DW2，8 000 r/min 離心1 min，丟棄收集管。（9）換用新的收集管，12 000 r/min離心3 min，丟棄收集管。（10）將吸附柱小心轉移至干凈的1.5 ml 離心管中，往DNA 吸附膜中心滴加30 ～100 l Buffer DTE（勿碰到DNA 吸附膜），室溫靜置1 ～5 min，12 000 r/min 離心1 min，收集樣品DNA 并保存。

1.5.2 基因組DNA（gDNA） 分別使用QIAamp DNA MiniKit 和QIAamp DNA Blood Mini Kit（凱杰公司，Hilden，德國）從腫瘤和鄰近腫瘤肺和白細胞層提取。使用Qubit 熒光儀和dsDNA 高靈敏度檢測試劑盒（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）測定DNA 濃度。使用Agilent2100生物分析儀（安捷倫科技，美國加州圣克拉拉）評估DNA 的分布。

2 結果

2.1 組織樣本病理形態學評估 93 例非小細胞肺癌樣本通過制作冷凍切片病理評估發現，有6 例與原診斷不符合，其中1 例診斷為肉芽腫性病變，1 例腸癌肺轉移，3 例癌組織內無癌細胞，1 例癌旁組織中有癌細胞；在315 份腫瘤組織中，腫瘤部分所占比例≥30%的占77.8%（245/315）；在204 份癌旁組織中，發現1份陽性樣本，1 份可疑陽性；在329 份正常組織中，發現8 份陽性樣本。總樣本的病理診斷合格率為93.55%（87/93），癌組織77.8%（245/315），癌旁組織99.02%（202/204），正常組織97.57%（321/329）。

2.2 RNA 的純度和完整性評估 在選取的172 份RNA 樣本中，RNA 純度OD260/280 為2.037±0.57，RNA 純度OD260/280≥1.8 占98.84%（170/172）；RNA 分子RIN 為7.47±1.69，RIN≥7 占82.56%（142/172）；RIN ＜4 占6.98%（12/172）。其中有1 份OD260/280 為9.4，RIN=1，RNA 已降解。

2.3 DNA 的濃度及質量 在選取的165 份DNA 樣本中，DNA 最大濃度為200.69 ng/ l，最小濃度為11.60 ng/ l，平均131.29 ng/ l，中位值134.07 ng/ l，低于60 ng/ l 的樣本5 份。條帶降解度＞1 000 bp 有161 份，500 ～1 000 bp 有3份，小于500 bp 有1 份。

3 討論

高質量及高標準的生物樣本庫是基礎和臨床研究的樣本來源，也是實現轉化醫學和精準醫學的物質基礎[3]。樣本質量是生物樣本庫的核心，對生物樣本庫的質量評估往往圍繞DNA與RNA進行[4-5]。然而，大約10%的冷凍樣本是不適合進行分子分析的，主要原因是樣本的取材和保存[2]。因此，組織樣本進行分子分析前進行病理評價是十分必要的。

本研究對生物樣本庫的組織樣本質量在組織形態學的基礎上進行評估，再進行核苷酸純度和完整性的檢測。通過冷凍切片對冷凍樣本的病理形態學分析發現，癌組織與正常組織的病理診斷結果產生偏移，而RNA 和DNA 質量是良好的，這說明生物樣本庫中冷凍樣本在RNA 和DNA 層面的結果是可行的。目前分子病理存在的主要問題是由于樣本導致的錯誤率較高。在實驗環節，分析前和分析后錯誤發生的頻率更高，由于分析問題導致的錯誤隨著時間的推移已經顯著減少，大部分錯誤是分析前造成的，占總錯誤的46%～68.2%[6]。在生物樣本庫分析前因素中，不僅關注患者的內在因素、熱缺血時間和冷缺血時間等[7]，更要在標準的操作規程（SOP）中進行嚴格的質量管理和質量控制，包括組織學的證實[8]。生物樣本庫實際保存的樣本與病理報告中的組織存在一定的差異，這種差異足以影響研究的結果[9]。在病理評估中，確認該組織是否是腫瘤組織及腫瘤細胞含量等都是決定下游研究結果的前提[10]。

本研究中癌旁組織和正常組織中出現陽性樣本，腫瘤組織樣本中腫瘤細胞所占比例≥30%的占77.8%，造成這種差異的原因可能是樣本庫組織取材較小，同一樣本腫瘤的分化程度不同，取材位置不同，腫瘤成分比例也不同，所取樣本不足以概括腫瘤全貌。樣本庫冷凍小組織也增加了冷凍切片的難度，皺褶、切片不完整等都有可能造成閱片時腫瘤細胞計數的偏差。對照RNA 及DNA 的結果表現，腫瘤細胞占比≥30%可以說明樣本的病理準確性。對研究用的樣本組織進行冷凍切片時，更要避免樣本污染，用熟練的冷凍切片技術和嚴謹的工作態度提高切片的質量，通過對冷凍樣本的病理質控，可進一步提高下游實驗結果的準確性。