視黃酸對細胞凋亡的調控作用及機制

劉 麗 ， 趙 智 ， 付 琳 ， 張 麗 ， 董賢文 ， 王高富

（1.重慶化工職業學院，重慶 401228；2.中共重慶市委黨校 經濟管理教研部，重慶400041；3.重慶市畜牧科學院，重慶 402460；4. 重慶市山羊工程技術研究中心，重慶 402460）

視黃酸（RA）是維生素A 在動物機體內的代謝終產物和功能活性物質，維生素A 維持動物機體正常生理代謝功能多是轉化為RA 來實現的（Napoli，2020）。 RA 通過調控多種目的基因表達影響生命活動進程，如細胞凋亡、免疫應答等，最終對動物健康和生產性能產生重大影響（Alatshan等，2020）。 在奶牛科學方面， 奶牛乳腺上皮細胞（BMEC）是乳成分合成和分泌的重要場所，其在奶牛的多個泌乳周期中， 循環性的經歷發育-分化-退化的生理過程 （Apfs，2020；Boisgard 等，2001）。 目前，對于通過提供不同營養元素滿足乳腺的泌乳需要，增強BMEC 的活性和數量，激活BMEC 合成乳成分相關的信號通路， 最終提升BMEC 泌乳性能的研究很多（Zhao 等，2021；Dong等 ，2018；Gao 等 ，2015）。 但 對 于 乳 腺 退 化 和BMEC 凋亡的研究較少。研究表明，乳腺退化期在奶牛泌乳周期中具有重要地位， 是維持和提升奶牛產奶性能的重要影響階段， 乳腺退化發生異常將會導致奶牛以后的泌乳性能降低 （狄和雙等，2009）。 乳腺退化主要是通過細胞凋亡途徑，減少BMEC 細胞數量來實現的。 奶牛乳腺退化主要發生在干奶期，研究發現，添加維生素A 可以通過調控BMEC 增殖和凋亡影響奶牛的生產性能。 研究表明，RA 對干奶期BMEC 凋亡和脂肪合成代謝具有顯著調控作用（Xu 等，2021）。 但是 RA 對BMEC 細胞凋亡的機制尚不明確。因此，本文主要從RA 的功能作用及體內轉運途徑、 細胞凋亡及信號通路以及RA 對細胞凋亡的調控3 個方面，闡述RA 對細胞凋亡的影響及調控機制， 以期為研究RA 調控奶牛乳腺退化和細胞凋亡進程，提升奶牛生產性能提供思路。

1 RA 的功能作用及體內轉運方式

1.1 RA 功能作用 全反式視黃酸（RA）是維生素A 在機體內的代謝終產物，也是微生素A 在體內發揮生物效用的功能性物質 （Tang 和Gudas，2011）。 維生素A 在視黃醇脫氫酶、視黃醛脫氫酶的作用下，首先經脫氧和雙加氧形成視黃醛，而后經不可逆氧化反應形成全反式視黃酸。 近年來研究發現，RA 在細胞增殖、分化、凋亡等方面都具有調控作用（Dos 等，2010）。 RA 發揮生物調控功能的實質是其以視黃酸受體（RAR）家族成員轉錄因子配體的形式進入細胞核，而后與核內RAR 家族成員結合， 并形成轉錄活化因子 （Rhinn 和Dollé，2012）。 轉運進入細胞核是 RA 發揮生物學功能的關鍵。

1.2 RA 的體內轉運 RA 的生成是在細胞質中發生的，其需要轉運到細胞核內，與相應的核受體RARs、視黃醇類 X 受體（RXR）和過氧化物酶體增殖物激活受體 β/δ（PPAR β/δ）等結合才能發揮生物活性功能。 由于RA 的長鏈脂肪酸結構具有疏水抑制性特征， 其限制了RA 自由的穿過細胞核的水通道，因此需要特定的轉運載體（Tang 和Gudas，2011；Noy，2010）。研究表明，一種包括 14~15 kD 分子大小蛋白的家族成員， 即脂結合蛋白家族，它們能夠與不同的類維生素A 和長鏈脂肪酸結合（Storch 和 Corsico，2008）。在脂結合蛋白家族中，RA-結合蛋白-II（CRABP-II）可用作 RA 與RAR 之間的傳遞，而脂肪酸結合蛋白5 （FABP5）轉 運 RA 給 PPAR β/δ （Tan 等 ，2002；Budhu，2001）。 這些轉運蛋白（CRABP-II、FABP5）在沒有配體RA 存在的情況下常存在于細胞質中， 在與RA 結合后轉移到細胞核。 在細胞核內，這些蛋白通過RA 的引導， 特異地與目的受體 （RARs 和PPAR β/δ 等） 相互作用形成復合物。 CRABP-II與 FABP5 因此促進了 RA 分別傳遞給 RAR 和PPAR β/δ， 并顯著提高了相應受體的轉錄活性（Tan 等，2002；Budhu 和 Noy，2002）。

2 細胞凋亡及信號通路

2.1 細胞凋亡 在動物生命周期中， 一些細胞會在特定的時間死亡，而被清除，這個過程稱為程序性細胞死亡。程序性細胞死亡一般是以細胞凋亡的形式發生和實現的（Jacobson 等，1997）。 細胞凋亡作為一種專門的細胞死亡形式，具有其自身專門的調控方式和凋亡細胞生理特征 （Schwartzman 和Cidlowski，1993）。 首先，正常細胞膜上的磷脂酰絲氨酸本身處于細胞膜內側， 當早期細胞凋亡的時候，細胞會出現生理性的特征，即磷脂酰絲氨酸外翻于細胞膜表面；而后凋亡細胞皺縮與相鄰細胞分離，細胞表面變光滑，微絨毛等結構消失；然后細胞骨架的肌動蛋白、 肌球蛋白受損導致質膜出泡，細胞核內染色質凝集，染色質上的核蛋白被核蛋白酶水解而產生DNA 片段，DNA 電泳呈現梯狀條帶；最后細胞膜內陷，將細胞包裹并分裂成多個凋亡小體， 裂解的細胞被周圍的吞噬細胞吞噬（Hengartner，2000；Earnshaw 等，1999）。 細胞凋亡是一種“安靜的”細胞死亡方式，不會產生炎癥反應。

2.2 細胞凋亡依賴的Caspases 信號通路 天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（Caspase），是一類能夠特異水解含天冬氨酸殘基底物的半胱氨酸蛋白酶。 Caspase 常以酶原的形式存在， 其自身特點為： （1） 有一個保守的含Cys 殘基的活性位點，該位點是酶催化活性所必需的。（2） Caspase 識別底物酶切位點 N 側的至少 4 個氨基酸殘基（P4P3P2P1），P1 必須是 Asp 殘基。 （3） Caspase 酶原的活性很低， 需要切除氨基端的一段序列才能被激活（Earnshaw 等，1999）。 Caspase 按結構與功能分為三類：起始Caspase、效應Caspase 和炎癥Caspase，典型代表分別為 Caspase-8/-9，Caspase-3/-7/-6 和 Caspase-1（Fan 等，2005）。 細胞凋亡依賴的Caspase 信號通路主要有死亡受體信號通路（亦稱為胞外信號通路）和線粒體通路（又稱為胞內信號通路）。

2.2.1 死亡受體信號通路 在脊椎動物中， 死亡受體是腫瘤壞死因子受體（TNFR）家族的一個亞家族，包括腫瘤壞死因子受體1 （TNFR1）、凋亡因子Fas （Fas/CD95） 以及腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體（TRAIL）（Bratton 等，2000）。它們與相應的配體（TNF-α，Fas 和 TRAIL）結合后暴露出死亡結構域，從而與接頭分子，如Fas 相關結構域蛋白 （FADD） 的死亡結構域相互作用， 并暴露出FADD 分子中含有的死亡效應結構域（DED），DED 與起始Caspase-8 的前結構域上的DED 結合，從而使Caspase-8 二聚化，通過誘導臨近效應而 活 化 （Danial 和 Korsmeyer，2004；Lahm 等 ，2003）。 死亡受體、接頭蛋白與 Caspase-8 組成了死亡誘導信號復合體 （DISC）。 活化的起始Caspase-8 能激活下游的效應 Caspase-3/-7， 效應Caspase 產物相應的生理功能激活細胞凋亡（Boatright 和 Salvesen，2003）。

2.2.2 線粒體通路 線粒體受到相關刺激后，發生線粒體外膜通透化（MOMP），釋放出可溶性蛋白， 而后與凋亡蛋白酶活化因子-1 （APAF-1）結合，使其發生構象變化，從而使dATP 結合到APAF-1 上，使APAF-1 的構象再發生改變，寡聚化后形成7 個APAF-1 組成的復合體， 即凋亡（Bao等，2005；Hill，2003）。 隨后在凋亡體中心募集兩個Caspase-9，通過誘導臨近效應加工活化為具有活性的 Caspase-9。 活化的 Caspase-9 激活效應Caspase-3/-7，從而激活細胞凋亡。 MOMP 的發生是決定細胞“生”與“死”的關鍵所在，其發生受B淋巴細胞瘤-2 （Bcl-2） 家族蛋白的激活或抑制（Danial 和 Korsmeyer，2004）。 按 Bcl-2 蛋白家族的結構與功能，將其分為三類：抗凋亡蛋白（含有BH-1，-2，-3，-4 四個結構）， 促凋亡的多結構域蛋白（它們都含有 BH-1，-2，-3 結構域），促凋亡的僅含BH-3 結構的蛋白。 抗凋亡的Bcl-2 蛋白主要有 Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w 等 Bcl-2 亞家族蛋白，他們通過抑制MOMP 的形成抵抗凋亡的發生和發展。 多結構域促凋亡Bcl-2 家族蛋白主要有Bax 和Bak，它們被僅含BH-3 結構域的 Bcl-2 家族蛋白激活后， 發生寡聚化在線粒體外膜上形成孔隙，從而釋放出線粒體膜間隙中的可溶性蛋白，從而激活下游凋亡信號通路（Muthalagu 等，2014；Danial 和 Korsmeyer，2004）。

2.2.3 胞外、 胞內信號通路的交叉調控與凋亡抑制 凋亡的兩條信號通路， 盡管在某些方面存在很大的差異，但在通路中它們相互交叉作用，因此存在 “交叉調控” 的現象 （Danial 和 Korsmeyer，2004）。 胞外通路的Caspase-8 通過裂解并激活只含有BH3 結構域的Bid 蛋白， 從而促進Bax、Bak蛋白對MOMP 的形成， 激活胞內線粒體通路；胞內通路活化的Caspse-9 反過來能夠激活胞外通路的效應Caspase-3/-7。

凋亡信號通路活化過程中也受到很多抑制因素的調控，而不是無限制的促進細胞凋亡。既然效應Caspase 可通過裂解而被活化，而這些Caspases又可以相互裂解活化對方， 所以在細胞中， 任何Caspase 的蛋白水解酶活力都能被迅速放大， 進而導致細胞凋亡。 因此，存在一定的機制來限制沒有接受死亡信號的細胞中的Caspase 潛在的 “意外”活化極為重要。 X 連鎖凋亡抑制因子 （XIAP）是Caspase 的有效抑制因子，尤其能夠抑制效應Caspase-3/-7 和起始Caspase-9 的活性。 從而能夠抑制死亡受體引起的細胞凋亡（Vaux 和Silke，2005）。MOMP 后釋放的線粒體中調節細胞凋亡的蛋白質（Smac）和Omi 能夠抑制XIAP 從而活化效應Caspase-3/-7。Bcl-2、Bcl-XL 能夠抑制活化的 Bax、Bak從而抑制MOMP 的形成； 此外二者還能夠與活化的Apaf-1 結合， 從而抑制凋亡體的形成， 抑制Caspase-9 的激活（Vaux 和 Silke，2005）。

3 RA 對細胞凋亡的調控

視黃酸（RA）能夠通過促進細胞凋亡，特別是對腫瘤細胞的促凋亡作用，抑制腫瘤細胞的凋亡。反之，RA 還能夠抑制某些正常細胞受到不該受的凋亡刺激后發生的凋亡， 促進這些細胞的生長與健康。 因此，明確RA 對細胞凋亡的調控機制，有利于動物飼養過程中， 在適宜的生長和生產階段合理運用RA，提升其生物效用，改善動物的生產性能。

3.1 RA 促進腫瘤細胞凋亡

3.1.1 RA 通過Caspases 促進細胞凋亡 Donato和 Noy（2005）以乳腺瘤細胞 MCF-7 為模型，研究發現在 MCF-7 中，DNA 碎片化程度與 RA 的濃度呈劑量依賴關系。 并通過芯片矩陣分析825 個基因的表達量， 發現RA 提高了MCF-7 中Caspase-7、Caspase-9 基因 60%的表達量。而后，為了確定 Caspase-7、Caspase-9 是否是 RA 在轉錄調控上的直接目標， 進一步研究了蛋白合成抑制劑環己酰亞胺 （CHX） 對 RA 誘導 Caspase-7、Caspase-9 表達的作用。 環己酰亞胺處理會消除蛋白從頭合成，但不會影響直接的轉錄反應。 CHX 添加完全消除了RA 對Caspase-7 mRNA 表達的調控作用， 但對RA 誘導Caspase-9 mRNA 表達上調無影響。 說明RA 對Caspase-7 的作用是間接作用，而Caspase-9 是RAR 信號的直接目標（Do-nato 和 Noy，2005）。 因此，RA 可通過直接作用Caspase-9 對細胞凋亡進行調控。

3.1.2 RA 通過死亡受體通路促進細胞凋亡 有研究發現，RA 提高了頭頸部鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌細胞系腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體1（TRAIL-R1）蛋白 表達 （Dhandapani 等 ，2011；Danial 和 Korsmeyer，2004）。 RA 處理 細胞 12 h后，TRAIL-R1 發生表達并能維持到 24 h。 RA 添加濃度在100 nmol/L 能顯著提高TRAIL-R1 的表達水平。經RT-PCR 檢測發現，RA 是在轉錄水平促進TRAIL-R1 基因表達。 通過RAR 激動劑、拮抗劑以及基因沉默試驗研究發現，RA 是通過RAR 核受體調控目的基因TRAIL-R1 的表達。經染色質免疫沉淀分析發現，DR-11 為RA 核受體RAR 調控TRAIL-R1 基因表達的反應元件。死亡受體表達雖增加了，但需要配體的結合才能激發胞外死亡受體通路，從而促進細胞凋亡。 研究發現，在 22B 和 A549 細胞中，RA 與 TRAIL 聯合具有更大的效力來降低細胞生長和增加DNA片段化。 因此，RA 是通過激活死亡受體TRAILR1 的表達和提高TRAIL 配體活性來提高死亡受體介導的信號通路。

3.1.3 RA 通過胞內MOMP 促進細胞凋亡 線粒體膜外通透化（MOMP）是細胞凋亡調控的關鍵環節。MOMP 的發生受Bcl-2 家族蛋白的調控。研究表明，正常情況下Bax 蛋白的NH2-末端處于“掩埋”狀態，在受到應激時，Bid、Bim 等能夠將其激活，導致NH2-末端殘基暴露，從而轉移并插入線粒體外膜上（Martinou 和 Youle，2011）。 單克隆抗體 6A7 能夠特異識別 Bax NH2-末端。 Niu 等（2001） 用 RA 處理 MCF-7 和 ZR-75 細胞 96 h后，應用6A7 免疫組化發現：與對照組相比，6A7特異性反應的細胞增加大約3 倍， 且線粒體中細胞色素 C 大量釋放 （Niu，2001）。 因此，RA 調控Bcl-2 家族蛋白的表達， 影響MOMP 的發生是其調控細胞凋亡的重要途徑之一。

3.2 RA 抑制正常細胞凋亡的作用 RA 在抑制凋亡中的重要作用主要體現在：（1）保護受凋亡激活 的 造 血 干 細 胞 （Iwata 等 ，1992；Oritani 等 ，1992）；（2）阻止機械損傷和血管緊張素 II 觸發的心肌細胞凋亡（Choudhary，2008）；（3）保護 TNF-a介導的肺上皮細胞凋亡（Besnard 等，2002）；（4）抑制輻射引起的血管內皮細胞凋亡（Sorg 等，2005）。在山羊卵母細胞抗凋亡的研究中發現，RA 上調了山羊卵母細胞抗凋亡Bcl-2 蛋白的表達， 下調了促進凋亡Caspase-8 基因的表達， 最終抑制細胞凋亡 （Pu 等，2014）。 因此，RA 通過增強 Bcl-2蛋白的表達，下調Caspase-8 的活性，是抑制細胞凋亡的途徑之一。 此外，RA 可以通過調控其核受體抗細胞凋亡。 Schug 等（2007）研究發現，RA 可以上調PPARβ/δ 目的基因禁食誘導的脂肪因子（FIAF）、脂肪分化相關蛋白（ADRP）、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1（PDK1）的表達量，而PDK1 具有通過磷酸化激活存活因子（PKB/Akt）抑制細胞凋亡的作用。

3.3 RA 促凋亡與抗凋亡的平衡調控 促凋亡與凋亡抑制相互制約，兩者平衡調控是細胞凋亡調控的關鍵。RA 既有抑制凋亡的作用，又有促凋亡的作用。 研究發現，RA 通過 CRABP-II 上調 RAR 的反應元件（RARE），通過脂肪酸結合蛋白（FABP5）上調過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）的反應元件PPRE。比較CRABP-II 與FABP5 在腫瘤細胞與正常細胞中的表達水平發現，CRABP-II 的表達在癌細胞中表達量顯著降低， 而FABP5 的表達量顯著升高。 因此， 腫瘤的發生伴隨著CARBP-II/FABP5 比例的顯著降低。研究發現，當RA 存在時，乳腺癌細胞中CARBP-II/FABP5 的比例升高。通過轉染FABP5 表達型質粒載體， 以及CARBP-II siRNA 干擾使CARBP-II/FABP5 的比例發生翻轉。比例翻轉前，RA 少量直接作用于 PPARβ/δ 和它的目的基因 PDK1。 比例翻轉后，RA 顯著促進了PDK1 的釋放，抑制了細胞的凋亡。 因此，RA 對細胞促凋亡和抑制凋亡的平衡調控作用受到CARBP-II/FABP5 比例的影響。

4 小結

細胞凋亡控制著細胞的生與死， 對動物機體的正常生長和生產具有重大影響。視黃酸（RA）作為重要營養元素維生素A 的代謝終產物和功能活性物質， 具有通過調控細胞凋亡的方式影響動物生長和生產的功能。RA 調控細胞凋亡主要是通過Caspases 信號通路、 死亡受體信號通路和MOMP信號通路。 其核心過程為RA 經CARBP-Ⅱ和FABP5 兩種轉運載體轉運進入細胞核， 而后RA進入細胞核與相應核受體RAR 和PPARβ/δ 結合，通過激活核受體目的基因的反應元件調控相應基因的轉錄水平， 最終行使細胞凋亡調控功能。CARBP-Ⅱ和FABP5 兩種轉運載體的比例決定了RA 是促進細胞凋亡還是抑制細胞凋亡， 但是RA是否對CARBP-Ⅱ和FABP5 兩種轉運載體的比例具有調控作用尚不明確。 此外，RA 對于細胞凋亡調控方面的研究主要集中于人類健康和疾病防治方面，對于動物生長、發育方面的研究還不多。 因此，有必要加強RA 對動物機體生長發育調控方面的研究，以期為RA 或維生素A 的合理使用，提高動物生產性能提供理論支持和研究方向。