NPM異常表達對腫瘤細胞周期調控作用的研究進展

徐 駿，曹 恩，矢慶明，王 嘉，尹碧洋，況曉東

(南昌大學a.病理教研室； b.第二附屬醫院骨科； c.瑪麗女王學院2018級，南昌 330006)

所有真核生物的核糖體RNA(rRNA)在細胞核中合成，核糖體是細胞合成所需的蛋白質合成的分子機器。核仁磷酸蛋白(NPM)是一種重要的核蛋白，與細胞周期密切相關。NPM在調節細胞周期和凋亡中起著重要作用，主要涉及2個方面：其一，NPM直接影響細胞周期，參與核糖體合成，中心體復制和周期控制蛋白的調節[1]，其二，NPM還可以調節促腫瘤或抑制作用，抑制蛋白的活性并影響其靶基因的下游轉錄，從而調節細胞的增殖和凋亡[2]。本文就NPM異常表達對腫瘤細胞周期調控作用的研究進展進行綜述。

1 細胞周期特征

細胞的生長和增殖在整個生命周期中都受到仔細和嚴格的調控，G1/S測試點是最重要的調控開關之一。在這一轉折點上，細胞對不同的胞內和胞外刺激因素做出各種不同反應，即細胞分裂、細胞分化或生長停止、G1期停止等。同時在此期間，中心體結合的NPM被cyclin E和CDK2異二聚體復合物磷酸化，啟動中心體復制[3]。因此，在G1/S這個測試點，任何可能的損傷或者突變，如抑癌基因失活或癌基因激活，都可能導致異常的細胞增殖或轉化。有研究[4]表明，NPM蛋白敲除會導致中心粒數制NPM蛋白磷酸化會導致中心體復制失敗。

2 NPM的結構與功能

NPM，也稱為B23或N038，位于5q35，包括3個亞型，即NPM1、NPM2和NPM3，目前學術界對NPM1了解最為詳細。NPM蛋白的N端富含非極性氨基酸，具有組蛋白伴侶的功能，中間部分是核糖核酸酶活性區，負責組蛋白和核糖體的組裝，可以依賴乙酰化增加組裝水平。C端是含有核定位信號的核酸結合域。野生型NPM可通過核孔在細胞核和細胞質之間穿梭，參與細胞核和細胞質之間的運輸。穿梭過程受核輸出信號、核定位信號和核仁定位信號序列控制。NPM可以被一些激酶磷酸化，如酪蛋白激酶Ⅱ(CKⅡ)。NPM和CKⅡ共同位于細胞核中，調節細胞生長和凋亡[5]。

3 NPM異常表達對腫瘤細胞增殖及凋亡的影響

NPM異常表達，包括基因突變、過表達和沉默表達3種形式，對腫瘤細胞的增殖或凋亡產生影響。

3.1 NPM突變對腫瘤細胞增殖的影響

有研究[6-16]表明，NPM突變對許多惡性腫瘤，特別是對血液腫瘤發生發展尤為密切。

3.1.1 NPM突變與急性髓細胞白血病(AML)

FALINI等[6]首次發現成人AML中NPM1基因突變的檢出率為35.2%，正常核型AML中為61.7%，這揭示了NPM基因與血液腫瘤的相關性。近年來，AML中NPM1的異常表達引起了人們的關注和研究。AML中的NPM1突變可發生在FAB-AML的幾乎所有亞型中，最常見的突變是M4(發病率77%)、M5a(發病率71%)和M5b(發病率90%)[7]。目前，最常見的突變類型B和D是在相同的基因位點插入CATG和CCTG，而突變類型A是在野生型NPM1核苷酸序列的956-959位插入1個TCTG[8]。NPMI基因第12外顯子突變在原發性AML尤其是正常核型AML患者中發生率較高，具有特殊的臨床特征和較好的預后[9]。

3.1.2 NPM突變導致NPM突變基因胞漿異常定位

基因突變致NPM胞漿移位的白血病細胞稱之為NPMc+細胞。NAKAGAWA等[10]提出，C端色氨酸只在野生型NPM的核仁定位中起主要作用，但是在野生型NPM的細胞質移位中并無顯著性作用。當NPM1發生突變后，11-氨基酸殘基取代NPM1蛋白C端7-氨基酸，NPM1蛋白末端5個氨基酸均為VSLRK，導致NPM1蛋白C端288和290位點至少1個色氨酸發生突變，削弱了核定位信號，最終導致NPM1在細胞質中的異常定位。此外有研究[11]還發現，突變NPM1的C端產生額外的富含亮氨酸的核輸出信號序列，這增強了依賴于CRM1的核輸出信號。細胞核定位信號減弱，輸出信號增強，最終導致NPM1蛋白在細胞質中的異常定位。

FALINI等[12]通過基因轉染技術進一步證實突變NPM移位胞漿是通過CRM1依賴途徑，此外通過NES序列敲除實驗證明突變NPM只有在同時具有2種NES序列的情況下才能實現其胞漿的聚集。NPMc+的異常表達是多種因素共同作用的結果。

3.1.3 NPM突變(NPMc+)導致血液腫瘤增殖的可能機制

白血病細胞的惡性增殖可以通過p53依賴或p53非依賴途徑來促進。一方面，依賴P53途徑，通過影響p53的穩定性導致腫瘤細胞異常增殖。P53是一種腫瘤抑制基因，由于其突變常導致腫瘤發生。受損DNA和癌基因的表達被激活，轉錄反應開始，最終導致細胞周期停滯或凋亡。正常情況下，p53處于動態平衡狀態，p53蛋白的穩定性受HDM2(人雙微體基因2)調節，HDM2是泛素E3連接酶，下調P53活性。它也由核仁素的抑癌基因蛋白富精氦酸因子(ARF)調節，該因子與HDM2相反。NPM從核仁中分離出ARF。隨著基因毒性刺激的激活，ARF轉移到核質，通過下調HDM2穩定p53，并激活p53依賴性細胞周期停滯或凋亡。但是NPM突變(NPMc+)卻維持與ARF聯接能力，在胞質分離。移位到胞質的ARF導致自身部分降解，p53失去穩定性，腫瘤抑制能力減弱，導致腫瘤細胞的異常增殖[13]。另一方面，ARF自身就有抑制核糖體合成、阻止細胞周期的功能，因此它的失活也將導致P53非依賴途徑失活,刺激核糖體合成和促進細胞周期進程,使細胞過度增殖[14]。因此，NPM突變可導致抑癌基因ARF和P53的失活，加上致癌基因的刺激，多因素作用促使細胞發生惡性增殖。此外胞質中的NPM1突變蛋白可降低抑癌蛋白生長素應答因子的活性、增強原癌蛋白c-Myc的穩定性，從而發揮促進細胞惡性增殖和抗凋亡作用[15-16]。

3.2 NPM過表達對腫瘤細胞增殖的影響

3.2.1 實體腫瘤中NPM基因往往過表達

細胞以分裂的形式進行增殖，是生物體生長、發育、繁殖、遺傳的基礎。NPM蛋白在腫瘤及增殖期細胞中的含量約是靜止期細胞的20倍。此外NPM1在多種腫瘤細胞中(如胃[17]、結腸[18]、卵巢和前列腺腫瘤[1])過表達，可直接參與腫瘤的發生且NPM1的表達水平與腫瘤發展階段成正相關，但目前在實體腫瘤中還沒有觀察到有NPM序列的突變[19]。鄢超等[20]發現NPM1蛋白的陽性表達率在結直腸癌淋巴結轉移患者中顯著高于無淋巴結轉移的患者，淋巴結轉移患者的預后往往比無淋巴結轉移的患者要差,這些結果提示NPM1蛋白的表達與結直腸癌患者的預后密切相關。雌激素是子宮內膜癌的危險因素，它通過抑制NPM蛋白的泛素化而穩定NPM，并使其表達水平升高，提示NPM與子宮內膜癌存在相關性[21]。PIANTA等[22]通過免疫組化檢測發現NPM在甲狀腺腺癌和良性濾泡腺瘤均有表達，且在甲狀腺腺癌中顯著過表達，提示NPM可作為甲狀腺癌的早期事件。體外研究[23]表明，NPM基因轉染正常成纖維細胞NIH3T3，發現過量NPM能夠促進正常細胞惡性轉化，體內實驗證實高表達NPM的NIH3T3細胞可使裸鼠致瘤。

3.2.2 NPM過表達調控細胞增殖抑制凋亡的可能機制

腫瘤細胞和生長細胞中NPM含量顯著高于靜止細胞，而凋亡細胞中的表達則下調[24]。雖然還沒有直接證據證明NPM的過表達參與了細胞周期的控制，但NPM作為一種抗凋亡蛋白間接參與了相關的機制[25]。抑制細胞凋亡的機制如下:1)在NIH3T3成纖維細胞中，NPM過度表達會導致細胞轉化，從而抵抗紫外線誘導的細胞凋亡，并通過上調PCNA和增加DNA修復來維持增殖[26]；2)在缺氧細胞中，NPM可以抑制P53第15位絲氨酸的磷酸化，從而抑制凋亡的發生[27]；3)NPM可以控制ARF的定位并與Mdm2競爭結合ARF，而NPM通過定位核仁和破壞ARF-Mdm2結合來抑制P53活性[28]；4)GURUMURTHY等[29]認為NPM1蛋白是一種HEXIM1結合蛋白(HEXIM1是RNA聚合酶Ⅱ的關鍵調節因子P-TEFb的抑制蛋白)，對HEXIM1起負調節作用。因此，從這些機制研究中可見，NPM1蛋白的過表達可使RNA聚合酶Ⅱ的轉錄激活，從而影響細胞增殖。

3.3 NPM基因沉默性表達對腫瘤細胞增殖的影響

NPM基因沉默常常影響細胞周期，其主要表現為促進細胞凋亡。

3.3.1 NPM基因的沉默性表達促進腫瘤細胞的凋亡

余秀琴等[30]的研究表明，siRNA沉默NPM基因表達可顯著降低皮膚鱗狀細胞癌A431細胞的增殖活性，并引起細胞周期停滯，表明細胞生長受到顯著抑制。LOBELLO等[3]構建了NPMl-RNAi抗HL-60細胞及其耐藥細胞系(HL-60/A DR)的細胞模型，轉染后能有效抑制HL-60細胞和HL-60/ADR中NPM蛋白的表達。石靜嫻[28]的實驗結果發現，在調節腫瘤細胞沉默NPM后，通過MMT檢測其增強了腫瘤細胞間的粘附能力，降低了遷移能力。這些結果都表明NPM的沉默表達抑制了腫瘤細胞的增殖。

3.3.2 NPM沉默性表達導致凋亡的可能機制

細胞周期的G2/M期阻滯發生在NPM沉默后[28]。AVITABILE等[31]指出NPM沉默表達抑制前RNA合成的產生，引起P53靶基因P21和MDM2的表達，提示NPM在調節rRNA產生和控制P53通路中起重要作用，最終促進細胞凋亡。NPM還下調信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)并抑制細胞增殖[28]。Caspase-3是凋亡早期激活的關鍵蛋白酶。活性的Caspase-3在腫瘤組織中低表達，加速增殖，抑制凋亡，促進腫瘤的發生發展。有學者研究[28]表明，在人成骨肉瘤細胞MG63中，NPM沉默后，活化的Caspase-3表達上調，促進細胞凋亡，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調，表明Caspase家族和Bcl-2家族參與了細胞凋亡的調控。此外，石松林等[32]通過姜黃素誘導食管癌EC9706細胞凋亡，發現姜黃素處理后，NPM穿梭于細胞質中，激活下游促凋亡蛋白，起到加速凋亡過程的作用；NPM可抑制細胞核內相應促凋亡蛋白如p53的活性，維持細胞的存活。

4 小結

NPM在調控細胞周期中起重要作用，NPM突變影響腫瘤細胞的耐藥性，NPM高表達往往使腫瘤細胞抑制功能減弱，而出現異常增殖的現象，提示了在早期發現、確診、預后方面檢測NPM蛋白表達的有效性。控制NPM的下調或NPM基因敲除均能引發癌細胞或損傷細胞凋亡。此外，在組織損傷引發的核仁應激反應中，NPM重定位并且也能夠引發細胞凋亡。在NPM異常表達對細胞增殖凋亡的調控機制中，P53通路有不可忽略的作用，這為探討通過NPM控制癌細胞增殖的過程提供了思路。