選擇性剪接在SARS-CoV-2感染中的調控作用

孫綺思，蘇中靜，2

(1．汕頭大學醫學院組胚教研室，廣東 汕頭 515041；2．汕頭大學醫學院廣東省感染與免疫重點實驗室，廣東 汕頭 515041)

嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是引起新型冠狀病毒肺炎流行的病原菌，感染SARS-CoV-2的患者可能引發嚴重的急性呼吸窘迫綜合征[1-2]。約翰斯·霍普金斯大學的疫情追蹤數據顯示，截至2021年6月4日，全球累計新型冠狀病毒肺炎確診病例超17 000萬例，累計死亡超360萬例。SARS-CoV-2病毒的感染在全球范圍內對人類的生活和生產造成了重大影響，因此研究SARS-CoV-2感染人體的機制以及病毒與人體細胞的相互作用備受關注和重視。

SARS-CoV-2屬于正鏈RNA β型冠狀病毒，核酸長度約為30 kb，其轉錄本有5′帽和3′端多聚A尾結構。SARSCoV-2正鏈RNA至少編碼29種蛋白質，其中包含刺突蛋白、小包膜蛋白、膜蛋白和核衣殼蛋白4種結構蛋白，16種非結構蛋白以及9個假定的輔助蛋白。SARS-CoV-2的正鏈RNA需要宿主細胞的組件來完成其蛋白質的翻譯和運輸，并組裝和分泌病毒顆粒，這些蛋白幫助病毒轉錄本占據宿主細胞內蛋白表達主導地位，抑制宿主細胞的正常轉錄與翻譯[3-4]。

選擇性剪接指同種mRNA前體通過不同的剪接方式產生多種亞型的過程，所形成的蛋白質產物可有不同的結構特性和功能。以往研究發現淋巴細胞中約60%的基因表達不同的剪接亞型，提示初始mRNA的選擇性剪接廣泛參與了免疫細胞的分化和免疫應答的調節[5-6]。近期的研究發現SARS-CoV-2進入宿主細胞的同時伴隨著眾多選擇性剪接事件，它們不僅幫助病毒進行高效的復制和轉錄，還使病毒有效地躲避機體的免疫反應[7-8]。本文綜述選擇性剪接在SARS-CoV-2入侵宿主、宿主細胞免疫反應以及病毒逃避免疫過程中的調控作用等的相關研究。

1 血管緊張素轉換酶2的選擇性剪接可能干預SARS-CoV-2的入侵

血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)是Ⅰ型跨膜蛋白，宿主細胞ACE2與刺突蛋白S1亞基上的受體結合域結合，引發了刺突蛋白的裂解，誘發膜融合和感染[9]。生物信息學預測ACE2基因的5′端、3′端和內含子區域存在可能參與選擇性剪接的假定外顯子，這些外顯子或可取代SARS-CoV-2入侵宿主所需的ACE2結構域，同時保留ACE2在人體內的生理功能。剪接開關寡核苷酸(splice-switching antisense oligonucleotides，SSOs)是一種可與核內前體mRNA的靶序列進行堿基配對的短合成反義序列，ACE2基因的選擇性剪接模型實驗提示有可能通過SSOs的作用，調控ACE2序列中SARS-CoV-2識別相關的選擇性剪接外顯子的表達，從而干預SARS-CoV-2對宿主細胞的感染[10]。

2 非結構蛋白16調控宿主mRNA的選擇性剪接

冠狀病毒的非結構蛋白(nonstructural protein，Nsp)通常參與病毒遺傳物質的翻譯及其產物的折疊和運輸，并調控宿主的蛋白表達和免疫應答[11]。Nsp16是一個2′-O-甲基轉移酶，它在Nsp10的協助下促進病毒mRNA帽2′-O甲基化，提高病毒翻譯效率，抑制宿主的mRNA[12-13]。Banerjee等[14]發現SARS-CoV-2基因組編碼的Nsp16與snRNA U1的5′端剪接位點識別序列和U2的分支點識別位點結合，從而導致宿主細胞的mRNA剪接缺陷。Nsp16作為宿主毒力因子，通過觸發異常剪接來破壞全局內源性mRNA的加工，最終造成宿主細胞mRNA和蛋白水平的衰退。

3 病毒基因組結合宿主細胞RNA結合蛋白調控選擇性剪接

RNA結合蛋白可以結合mRNA并調控mRNA的剪接加工或翻譯過程[15]。Srivastava等[16]通過轉錄物剪接的復制多變量分析方法發現，SARS-CoV-2感染細胞中發生選擇性剪接事件的基因存在大量跳躍和互斥的外顯子事件，并發現大量RNA結合蛋白編碼基因表達選擇性剪接亞型，它們可能會改變宿主細胞的轉錄后下游調控網絡。SRSF1、RNPS1和hnRNP A1都是參與選擇性剪接的RNA結合蛋白，SRSF1缺失導致的基因組失穩可通過RNPS1的過度表達來糾正[17-18]。Rogan等[18]通過模型預測分析發現SRSF1、RNPS1和hnRNP A1在SARS-CoV-2 RNA上存在許多結合位點，宿主感染后和病毒基因組之間存在著對這些RNA結合蛋白的競爭，可能會改變宿主細胞全基因組的選擇性剪接。

4 宿主miRNA和病毒miRNA形成雙重機制參與選擇性剪接

基因組經過選擇性剪接生成的多種異構體miRNA主要與mRNA 3′端互補結合、調控蛋白水平。Sa?ar等[19]預測出30個靶向1 367個人類基因的病毒成熟miRNA樣序列。Yu等[20]研究發現病毒miR-200c-3p靶向細胞ACE2mRNA的3′UTR。SARS-CoV-2感染細胞中存在大量可能改變轉錄后調控的選擇性剪接事件，宿主來源的miRNA作為調節因子與病毒基因組相互作用參與這些剪接過程[16]。一些人類miRNA可以靶向SARS-CoV-2基因組各區域，例如，hsamiR-17-5p、hsa-miR-20b-5p和hsa-miR-323a-5p靶向可讀框1ab區域[21]，miR-374a-3p靶向刺突蛋白基因[16]。7個與病毒mRNA完全互補的人類miRNA已被鑒定，其中miR-3611、miR-3691-3p和miR1468-5p在可讀框1a上，miR-5197和miR-3934-3p在S區上，miR-8066和miR-1307-3p在N區上[22-23]。

病毒來源的miRNA靶向宿主多個特定通路，劫持宿主miRNA，保護病毒mRNA免受降解，抑制細胞凋亡與自噬。而細胞來源的miRNA吸附病毒mRNA的3'-UTR，導致這些miRNA與宿主mRNA的結合減少，改變了宿主基因的表達。兩種來源的miRNA形成作用網絡對SARS-CoV-2產生了雙重作用[24]，它們在感染細胞選擇性剪接過程中的具體作用機制還有待進一步研究。

5 選擇性剪接調控干擾素刺激基因網絡的抗病毒作用

有證據表明，SARS-CoV-2對干擾素敏感[25]。干擾素與其誘導的干擾素刺激基因(interferon stimulated genes，ISGs)為機體建立抗病毒狀態，ISGs在宿主細胞內的選擇性剪接可改變ISGs蛋白的定位和活性[26-27]。Banerjee等[14]模擬經干擾素信號介導的堿性磷酸酶報告基因，發現該干擾素應答基因在Nsp16的表達和添加干擾剪接體組裝的小分子時受到強烈抑制。此外，SARS-CoV-2的mRNA 3′端有大量CpG位點，ISGs編碼的鋅指抗病毒蛋白可靶向這些CpG位點，也可通過產生不同長度的鋅指抗病毒蛋白亞型來限制病毒基因組的表達[28]。

6 小結

自新冠病毒被鑒定后，許多研究證明了病毒與宿主細胞之間通過各種相互作用增加其各自的蛋白表達形式并調控對方的基因表達。病毒Nsp、miRNA、宿主蛋白相互作用調控宿主基因表達的多個剪接環節，發揮協助病毒感染和增強宿主抗病毒免疫反應的作用。目前，備受關注的是干擾素刺激的下游靶基因網絡通過選擇性剪接作用抑制病毒的入侵和復制。在SARS-CoV-2感染過程中，探索這些RNA剪接事件有利于為未來開發新的治療方法與防控新型冠狀病毒肺炎提供新的思路。