上皮間充質轉化與呼吸系統疾病研究進展*

陳冠穎 俞萬鈞 王華英

1 寧波大學醫學院，浙江省寧波市 315211； 2 寧波大學附屬人民醫院呼吸與危重癥醫學科

上皮間充質轉化是指上皮細胞逐漸失去其原有的特性和功能，并獲得間質細胞(成纖維樣細胞)表型的過程。在20世紀70年代末，Elizabeth Hay首先觀察到EMT的過程及其在胚胎發育中的重要性，提出該概念并展開討論。隨后，EMT在胚胎發育、原腸胚形成以及神經嵴、心臟和其他器官的發育和成熟中的重要作用被陸續發現。1985年，Stocker等[1]證明，成纖維細胞的培養上清能夠誘導犬腎上皮細胞分散和遷移。EMT還與組織器官的修復、慢性炎癥、纖維化以及多種腫瘤的發展有關，包括腫瘤的轉移和耐藥性[2]。EMT被劃分為三種不同類型：第一種發生在胚胎發育過程中，第二種與組織損傷修復有關，第三種類型發生在癌癥的發展過程中。

1 EMT的細胞改變及調控

1.1 細胞狀態變化 上皮細胞在上皮間充質轉化的過程中發生了重大變化，可分為四大功能轉變：基因轉錄調控的轉變、細胞骨架和運動能力的變化、細胞黏附功能變化以及細胞外基質(Extracellular matrix,ECM)的成分改變。值得注意的是，無論是生理發育過程還是在病理狀態下，從上皮細胞到間充質細胞的狀態轉變往往是不完全的，導致細胞處在中間狀態，同時保留有上皮和間充質的特征。由于EMT的程度取決于不同的生長環境，因此EMT不會導致單一的間充質狀態，而是導致具有不同程度上皮和間充質特征的多樣化中間狀態[3]。

EMT過程中，細胞間的緊密連接丟失，上皮特異性標記如細胞角蛋白(Cytokeratins)、E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等表達下調，間充質標記如纖維連接蛋白、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、N-鈣粘蛋白(N-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)的表達增加。細胞角蛋白是上皮細胞特有的中間絲，在EMT過程中，細胞被重編程轉而表達波形蛋白。成纖維細胞特異性蛋白-1(Fibroblast specific protein-1,FSP-1)與細胞遷移能力增加、腫瘤侵襲性以及更差的肺癌預后相關，在EMT過程中獲得表達。α-SMA也是評估EMT的一個常用指標，α-SMA的表達是肌成纖維細胞的特征，肌成纖維細胞通過分泌過多的細胞外基質導致氣道重塑和纖維化。此外，緊密連接相關蛋白如Occludins和ZO-1、閉合蛋白(claudins)和E-cadherin在EMT中表達下調，引起細胞間連接的分離。

1.2 EMT的調控 EMT是通過復雜的分子途徑調節的，這些作用途徑包括microRNAs、表觀遺傳調控和翻譯后的選擇性剪接[4]。目前的研究表明大量細胞因子和轉錄因子參與調控EMT過程，細胞因子包括轉化生長因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)、表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)、胰島素樣生長因子(Insulin like growth factor,IGF)、成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor,FGF)等，轉錄因子包括Snail、Slug、Twist、β-catenin、ZEB-1/ZEB-2和Tcf/LEF等[5]。這些轉錄因子已被證明可與參與轉錄調控的多種蛋白(包括在表觀遺傳修飾中發揮作用的蛋白分子)相互作用，與之共同形成調控復合物。TGF-β是目前EMT中研究最廣泛的細胞因子之一，可通過Smad信號通路的激活引起Zeb2和Snail的上調，進而抑制E-cadherin、ZO-1、Occludin等的表達[6]。此外，細胞外基質如膠原或缺氧條件，在與細胞因子和轉錄因子相互作用并誘導EMT中也發揮著重要作用。

2 EMT在慢性阻塞性肺疾病中的作用

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以肺氣腫為特征，同時伴有氣道重塑和炎癥，并且與肺癌密切相關[7]。氣道阻塞會導致COPD患者的氣流受限，而香煙煙霧引起的氣道重構是其重要原因[8]，但氣道重塑的機制目前尚未完全闡明。EMT過程可能是這一病理過程中一個重要的潛在機制。近幾年的研究表明，上皮間充質轉化在吸煙者和COPD患者的氣道中進展活躍[9]，氣道上皮和網狀基底膜裂隙的細胞中出現更多的EMT相關轉錄因子和間充質標記物，而且與肺功能下降和戒煙相關。此外，幾種細胞外基質降解酶，如基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9、基質金屬蛋白酶12、彈力蛋白、FSP-1也被發現表達升高[10]。

TGF-β和SHH信號通路被證明在誘導慢性阻塞性肺疾病和EMT時受到顯著激活，是COPD發生EMT的主要通路。Nishioka等[11]將COPD患者的肺成纖維細胞培養基與人支氣管上皮細胞(Human bronchial epithelial cells, HBEs)共培養后發現成纖維細胞條件培養基能誘導后者部分上皮間質轉化，這表明慢性阻塞性肺疾病中常駐的成纖維細胞和上皮細胞之間的相互作用可能是驅動上皮間質轉化的關鍵因素。

EMT已經被證明與良性肺疾病如COPD轉變為肺惡性腫瘤有關。吸煙是肺癌和慢性阻塞性肺疾病有一個共同的病因。此外，即使戒煙后，慢性阻塞性肺疾病的存在可使肺癌的發病風險增加4～5倍，這表明慢性阻塞性肺病的特定機制可能與肺癌的發展有關。研究發現腫瘤內的EMT活性與未受腫瘤影響的氣道壁上皮的EMT活性密切相關，這表明氣道壁的EMT活性水平可以潛在地用作最有可能發展為COPD和肺癌的吸煙者的標志物[12]。這些研究結果明確地表明，EMT是慢性阻塞性肺疾病和肺癌之間存在的潛在聯系。

3 EMT在支氣管哮喘中的作用

哮喘是一種復雜的氣道慢性炎癥性疾病，其表現為可逆性氣流受限、氣道高反應性和氣道重塑[13]。Johnson等[14]通過塵螨誘導的小鼠哮喘模型發現β-半乳糖苷酶標記的氣道上皮細胞逐漸失去上皮特征如E-cadherin、Occludin，而間充質標記物如波形蛋白、α-SMA等表達增加，并遷移到上皮下組織，這為慢性哮喘小鼠模型發生EMT提供了證據。作者認為該哮喘模型中，由Th2細胞主導的慢性炎癥增加了嗜酸性粒細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和平滑肌細胞分泌的TGF-β，并儲存在細胞外基質中，進而誘發EMT。卵清蛋白(Ovalbumin,OVA)哮喘模型小鼠是最常用的哮喘動物模型，在研究中被觀察到支氣管周圍炎性細胞浸潤增加、平滑肌層增厚和膠原沉積，伴有間充質標志物表達增加及上皮標志物表達減少[15-16]，Liu等[17]同時在哮喘患者及OVA哮喘模型小鼠中觀察到了EMT現象，這些研究表明哮喘的氣道重塑過程伴隨著EMT的發生。

一般認為哮喘是一種過敏性炎癥，其特征是氣道的嗜酸性粒細胞浸潤。有研究發現經氣管內滴注嗜酸性粒細胞可以誘發小鼠氣道上皮EMT，體外肺上皮細胞與嗜酸性粒細胞共培養也獲得了同樣結果[17-18]，進一步說明氣道嗜酸性粒細胞炎性浸潤可以促進EMT。然而，有觀點認為目前哮喘肺組織中的上皮間質轉化是有爭議的，原因是與慢性阻塞性肺病不同，成人哮喘患者的肺氣道上皮組織中沒有表現出活躍EMT的核心結構特征，如網狀基底膜斷裂、細胞增生或血管過多的跡象。

4 EMT在特發性肺纖維化中的作用

特發性肺纖維化(IPF)是一種原因不明的進行性纖維化肺疾病，隨著病程的發展，肺組織形成纖維化瘢痕，從而阻礙氧氣的肺內交換，并導致呼吸困難。由于缺少有效的治療手段，目前IPF患者確診后的中位生存期僅2～5年[19]。該疾病的主要病理特征是纖維化區大量的成纖維細胞聚集，并分泌大量的細胞外基質，形成成纖維細胞病灶(Fibroblast foci，FF)[20]。這些成纖維細胞病灶出現在正常組織和纖維化組織之間，是組織纖維化和疤痕的形成中心[21]。FF的形成主要有三種假說，包括組織常駐成纖維細胞來源、骨髓源性成纖維祖細胞來源以及肺泡上皮細胞經EMT而來，目前越來越多的證據支持肺泡上皮細胞來源說。IPF患者成纖維細胞病灶周圍正常組織中的肺泡上皮細胞被證實同時表達上皮和間充質標志物[22]，且小鼠肺纖維化模型中的細胞譜系示蹤實驗也表明肺纖維化小鼠氣道的間充質表型細胞來源于上皮組織[23]，這些研究成果都將FF的形成源頭指向EMT。

IPF中EMT的激活可能有幾種潛在的觸發因素，除了TGF-β、Notch和Wnt/β-catenin等公認EMT相關的信號通路，近些年來的研究發現miRNAs、內質網應激和未折疊蛋白反應(Unfolded protein response, UPR)等在肺纖維化中的EMT過程中也發揮著重要作用，是目前研究的熱點。雖然TGF-β抑制劑如比菲尼酮已被廣泛用于延緩肺纖維化進展，但目前臨床上仍缺乏特效藥物。已有研究表明多種miRNAs能影響Smad蛋白的表達進而調控TGF-β1誘導的EMT[24]，此外，Liu等[25]發現組蛋白去乙?；?HDAC)能通過誘導內質網應激促進肺上皮細胞EMT，這些新發現可能為IPF的治療提供新的靶點。

5 EMT在肺癌中的作用

癌變的上皮細胞可以通過3型上皮間充質轉化發生遷移，侵入周圍組織間質，并通過血液和淋巴系統擴散到遠處形成癌癥的侵襲和轉移。發生EMT的細胞可能獲得對凋亡的抗性和循環腫瘤細胞表型[26]，研究表明，EMT與腫瘤發病率的增加、對多種治療方案耐藥性的產生、免疫逃避、代謝改變和基因組的不穩定性息息相關。

在非小細胞肺癌中，上皮間充質轉化表型與耐藥性、EGFR(表皮生長因子受體)突變和腫瘤干細胞的形成密切相關，其特征在于豐富的腫瘤干細胞表型和更強的癌變潛能[27]。研究表明E-鈣粘蛋白和連環蛋白表達的減少或喪失是非小細胞肺癌的不利預后因素，而波形蛋白和Snail蛋白的表達也與非小細胞肺癌的惡性表型相關[2]。此外，吉非替尼耐藥的A549表現出紡錘形形態以及間充質標記波形蛋白的較高水平表達，并伴隨著E-鈣粘蛋白的降低，提示存在上皮間質轉化。而激活非小細胞肺癌細胞中的TGF-β信號可誘導EMT，使腫瘤細胞對埃羅替尼不敏感；并且在進行埃羅替尼治療前，埃羅替尼耐藥的間充質表型細胞已經存在于細胞系和腫瘤中。Tripathi等[28]研究發現EMT可以誘導腫瘤細胞產生對T細胞介導免疫反應的免疫逃避，間充質表型的非小細胞肺癌細胞表達低水平的免疫蛋白酶體，并抑制CD8+T細胞相關抗原的呈遞，而免疫蛋白酶體缺乏與非小細胞肺癌預后不良相關。

綜上所述，目前關于EMT在纖維化和腫瘤中的意義逐漸得到揭示，人們也意識到EMT并不是一個雙終點的二元過程。但關于抗EMT藥物的研究還相對較少，主要為體外實驗，人體和臨床研究尤其稀少，因此對于EMT的治療方案目前仍處于起步階段。隨著研究的逐漸深入， EMT和呼吸道疾病的相關機制得到闡明，可為其在部分肺部疾病的治療上提供新的治療策略。