山羊GDF9-L61L變異位點檢測及其遺傳效應分析

畢 誼，康雨欣，何禮邦，潘傳英，朱海鯨，屈 雷，藍賢勇*

(1. 西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100; 2. 陜西省陜北絨山羊工程技術研究中心，生命科學學院，榆林學院，陜西 榆林 719000；3. 陜西浩麗絨山羊科技發展有限公司，陜西 榆林 719000；4. 陜西省四主體一聯合肉羊工程技術校企聯合研究中心，陜西 榆林 719318)

目前，中國山羊產業面臨著許多挑戰，如優良種畜缺乏、飼料資源缺乏等。其中，群體生產性能差等問題顯著影響產業經濟效益。因此，深入研究影響山羊經濟性狀的遺傳因素是十分必要的[1-2]。陜北白絨山羊具有耐寒、耐粗飼、抗病力強等特點，是陜西省數量最多、經濟價值較高的山羊品種，但其在體型及產肉性能方面仍有待提高[1]。

生長分化因子9(Growthdifferentiationfactor9,GDF9)基因是生長分化因子β(TGF-β)超家族的特殊成員之一[3-5]，除在卵巢中最高表達外，廣泛表達于垂體、下丘腦和子宮等20多個組織，這表明該基因可以差異地影響某些生理途徑、代謝和表型表達[6-7]。同時，GDF9基因作為卵巢內的調節劑，在早期卵泡的形成中發揮重要作用，并在山羊卵泡發育全階段均穩定表達[8]。有研究表明，在山羊離體前卵泡的長期培養過程中，GDF9和FSH可維持卵泡的完整性并能促進原始卵泡的活化和完整性[9]，以上研究均表明GDF9能夠作為一個高繁殖力候選基因應用于山羊育種工作。目前，在該基因上檢測到的40余個單核苷酸多態性(Singlenucleotidepolymorphism，SNP)突變位點已在全球30多個山羊品種上廣泛研究[10]，并發現GDF9基因多態性不僅能夠影響山羊繁殖性能，也與生長密切相關[11-13]，但目前有關山羊GDF9基因多態性與生長性狀的研究較少。2019年，山羊GDF9基因上的兩個強連鎖SNP位點Q320P和V397I在山羊大群體中被發現能穩定且顯著地影響山羊產羔數[12]。隨后，發現GDF9-L61L位點與該基因的兩個強連鎖且能顯著影響山羊產羔數的位點Q320P和V397I，接近強連鎖關系[11]。由此提出假設：是否GDF9-L61L位點也同樣能顯著影響山羊的產羔呢？考慮到產羔與生長間具有一定關聯，那GDF9-L61L是否也與山羊生長性狀間存在顯著關聯呢？因此，本研究選用陜北白絨山羊為研究對象，擬鑒定位于山羊GDF9基因上的突變位點L61L，并分析其與產羔性狀和山羊生長性狀間的關聯性，以期為后續山羊分子標記輔助選擇育種提供更多有效的分子標記，加快優良生長性能山羊群體的培育速度。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及DNA提取

從陜西省榆林市選取健康的陜北白絨山羊母羊共371頭，采集其耳組織樣。各山羊均處于相同的生長環境并飼喂相同日糧。用剪耳鉗剪取試驗羊約3 g耳組織樣，放入含有1 mL體積的70%乙醇的1.5 mL離心管里，暫時保存于冰盒里帶回，提取DNA過程參照Wang等[14]。采樣過程中，采集山羊產羔數據及其體尺數據，其中包括體高、十字部高、體長、胸圍、管圍、胸深、胸寬及髖[15]。

1.2 PCR擴增及基因分型

根據NCBI數據上山羊GDF9基因的序列信息(GenBank序列號：NC_030814.1)，利用實驗室前期發表文章中已有的引物擴增目的片段[10]，其序列為：F: 5'-TTTGGTTTTGCTGCTTTGCCT-3'; R: 5'-TCTTTCTTCTTCCCTCCACCCA-3'。目的片段長度為409 bp。PCR擴增體系(25 μL)包括1 μL的基因組DNA模版 (10 ng/ μL),上下游引物各0.5 μL, 2 × Mix (擎科，西安) 12.5 μL，其余用ddH2O補足。

目的片段擴增利用降落PCR(Touch-down PCR)程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；68-50 ℃退火30 s(每個循環遞減1 ℃)，72 ℃延伸30 s，共18個循環；然后94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；共30個循環；最后72 ℃延伸10 min。其中，每個個體進行2個重復實驗，擴增產物利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，2個重復均能擴增出目的條帶的個體，將其PCR產物送至公司進行直接測序(擎科，西安)，鑒定分型。

1.3 數據分析

山羊GDF9-L61L位點的等位基因頻率、基因型頻率、基因純合度(Homozygosity，Ho)、基因雜合度(Heterozygosity，He)、有效等位基因數(Number of effective alleles，Ne)、以及多態信息含量(Polymorphism information content，PIC)通過直接計算獲得。利用卡方適應性檢驗鑒定各位點是否處于哈代-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium)狀態。

建立一般線性模型分析不同參數對山羊產羔和生長性狀的影響[16]：Yij=μ+Ai+Gi+eij。其中，Yij為觀測值，μ為群體均值，Ai為年齡固定效應，Gi為基因型固定效應，eij為隨機誤差。利用SPSS 23.0分析各基因型與生長性狀間的關聯性，其中，含有2種基因型的位點運用獨立樣本t檢驗，而含有3種基因型的位點利用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 SNP位點鑒定

根據測序結果，本試驗檢測到位于山羊GDF9基因外顯子1上的同義突變位點L61L(g.2006C>A/c.183C>A)(圖1)。該位點共含有3種基因型野生純合型(CC)、雜合型(AC)和突變純合型(AA)。

圖1 山羊GDF9基因L61L位點測序圖

2.2 群體遺傳參數分析

L61L含有3種基因型CC、AC和AA(表1)，該位點最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)為0.349。等位基因C為該位點的優勢等位基因，其等位基因頻率為0.651，三種基因型CC、CA和AA的基因型頻率分別為0.391、0.520和0.089。同時，L61L位于中多態性(0.25

表1 山羊GDF9基因L61L位點遺傳參數

2.3 L61L與產羔數間關聯性分析

分析GDF9基因L61L位點與產羔數間的關聯性發現(表2)，L61L對山羊產羔數間無顯著影響(P>0.05)。

表2 山羊GDF9基因L61L位點與產羔數間關聯性分析

2.4 L61L與生長性狀間關聯性分析

分析GDF9基因L61L位點與山羊生長性狀間的關聯性發現(表3，圖2)，位點L61L對陜北白絨山羊的管圍(P=4.95E-8)、胸深(P=5.02E-8)以及胸寬(P=4.72E-8)有顯著性影響。其中，雜合型CA在管圍和胸深兩個生長性狀中均為優勢基因型，含有CA基因型的個體呈現出更好的表型，但在胸寬性狀中，突變純合型AA為優勢基因型。但未發現L61L對山羊產羔數存在顯著影響(P>0.05)。

表3 山羊GDF9基因L61L位點與生長性狀間關聯分析

圖2 山羊GDF9基因L61L位點與生長性狀間關聯分析

3 討 論

已有研究表明，GDF9基因作為高繁殖力候選基因，是雌性個體卵泡發育的關鍵調節劑。同時，還參與影響動物的生長發育，因此，有關GDF9基因對動物經濟性狀的功能研究具有重要意義。此外，本團隊前期研究在山羊大群體(n>2000)中發現兩個位于該基因第2外顯子的Q320P和V397I位點處于強連鎖狀態，并能顯著影響山羊產羔數。與此同時，筆者前期研究又發現L61L位點與Q320P和V397I接近強連鎖狀態。因此本研究擬在陜北白絨山羊群里中鑒定L61L位點并研究該位點對產羔數的影響?？紤]到繁殖性狀和生長性狀的關聯性，筆者還同時分析L61L位點與生長性狀間的關聯性。

本文首先分析了這L61L在試驗群體中的分布情況。其最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)為0.349，這提示該位點在此群體中具有一個較穩定的突變頻率。然而，L61L位點并不處于哈代溫伯格平衡，這可能是由長期的人工選擇以及遺傳漂變等因素造成[17-19]。

隨后，又對L61L各基因型與山羊生長性狀間進行了關聯分析，結果表明L61L位點能顯著影響山羊胸深、胸寬和髖寬(P<0.01)。有前期研究報道，山羊DSCAML1基因的兩個indel位點能顯著影響該基因在不同組織中的表達量[20]，同時，山羊KDM6A基因上兩個indel位點的不同基因型也被檢測到，其表達量在不同時期仍有顯著差異[21]。因此，筆者猜測，L61L位點可能通過影響GDF9基因相關組織的表達量，從而參與山羊生長發育調節過程[22-24]。本團隊前期研究在大樣本群體中發現山羊GDF9基因兩個SNP位點(Q320P和V397I)處于強連鎖狀態，并能夠共同穩定且顯著地影響山羊產羔數。除此之外，MDM2基因中的40 bp indel位點與SNP(rs2279744)完全處于連鎖不平衡中，并且該SNP位點已被證明與多種癌癥的易感性有關，通過與SNP位點的連鎖，該indel位點與結腸癌風險呈正相關關系[25]。因此，L61L位點也可能與其他主效突變位點處于完全連鎖不平衡狀態，從而共同影響山羊生長性狀，但具體分子機制還有待進一步研究。

另外，從關聯分析結果中可發現，雜合型為管圍和胸深的優勢基因型，具有更好的表型，而突變純合型則為胸寬的優勢基因型，這表明雜合性對管圍和胸深更具有利，而突變純合型對胸寬更有利。因此，在后續的育種工作中，可以挑選出具有性狀對應優勢基因型的山羊個體，進行集中培育，將優勢性狀進行保留。雖然L61L與前期研究發現GDF9基因上對產羔數的影響發揮主效作用的位點Q320P有接近強連鎖的趨勢，但是可能由于跨外顯子且位置相隔較遠，導致Q320P與L61L的互作作用不足以使L61L也對產羔數有顯著作用。

4 結 論

本研究鑒定了位于山羊GDF9基因的L61L位點，其中L61L與山羊胸深、胸寬及管圍性狀間存在極顯著關聯(P<0.01)，提示該位點可作為有效的分子靶標應用于分子標記輔助育種中。