丁酸梭菌對小鼠健康狀況的影響

李玉鵬，李?；?，尚智援，張效生

（1.天津市農業科學院畜牧獸醫研究所，天津 300381；2.天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津 300384；3.天津師范大學生命科學學院，天津 300387）

近年來，我國對丁酸梭菌（Clostridium butyricum）的研究步伐正在逐漸加快。研究表明，丁酸梭菌作為重要的益生菌之一，不僅能夠產生多種營養物質（丁酸、氨基酸、維生素、纖維素等）和酶類（消化酶、蛋白酶等），供給機體利用，并且具有抗炎和提高免疫力等作用（Li 等，2018；Liao 等，2015；王騰浩，2015）。但有關丁酸梭菌調節小鼠生長性能、血清細胞因子含量及緊密連接蛋白表達的機制仍不十分清楚。因此，本研究通過在小鼠上應用丁酸梭菌，研究其對小鼠生長性能、血清細胞因子含量和腸道健康狀況的影響，為進一步揭示丁酸梭菌調節小鼠健康的機制，以及其在畜禽飼糧中的推廣應用提供基礎數據和理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗設計和飼養管理 本研究采用單因子設計，選擇32 只體況正常，體重為21.86 g 的昆明（KM）小鼠，按完全隨機區組設計分為4 組，每組8 個重復。4 個處理組均飼喂商品飼糧，即對照組、丁酸梭菌組（CB）、產腸毒素大腸桿菌K88 組（ETEC）以及CB+ETEC 組。對照組用0.2 mL 生理鹽水灌胃，CB 組用0.2 mL 2×106cfu/ml 的丁酸梭菌灌胃，ETEC 組用0.2 ml 2×108cfu/mL 的產腸毒素大腸桿菌K88 灌胃（該組攻毒前的處理同對照組），CB+ETEC 組攻毒前的處理同CB 組。攻毒24 h 后采集相關樣品。正式試驗周期為14 d，預飼期3 d，所有小鼠自由采食和飲水，期間觀察小鼠健康狀況并記錄小鼠腹瀉率和死亡率。

1.2 試驗材料及其處理 試驗所用丁酸梭菌為實驗室自己培養，原菌液活菌數為1×1010cfu/mL，試驗前將其稀釋到所需濃度。

1.3 生長性能 在正式試驗開始第1、7、14 天對小鼠稱重，計算每組平均體重。

1.4 樣品的采集 試驗結束時，在相對封閉的空間內用棉花蘸取乙醚，對小鼠進行麻醉，摘除眼球采血，當血液流盡時，用脫臼法處死小鼠。將血液裝于離心管中，置37 ℃溫箱1 h，待血液凝固，血塊收縮后，4000 g 離 心10 min，取上清，-20 ℃保存備用。無菌條件下迅速打開腹腔，分離并采集回腸腸管，用磷酸緩沖液（PBS）沖洗干凈置于凍存管中，-80 ℃保存備用。

1.5 指標測定及方法 采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒測定血清中二胺氧化酶（DAO）、腫瘤壞死因子（TNF-α）以及白介素-8（IL-8）的含量（均購自美國BD 公司）。采用Western blot 檢測回腸中靶蛋白ZO-1 和occludin 的含量（抗ZO-1 抗體、抗occludin 抗體和抗β-actin 均購自Abcam公司）。

1.6 數據分析 以單只小鼠為單位進行試驗數據統計，利用Excel 2016 對試驗數據進行初步分析；采用SPSS 19.0 統計軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），統計結果P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。采用Graph-Pad Prism 5 軟件進行圖像處理及分析。

2 結果及分析

2.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 由表1 可知，在1～14 d 階段，小鼠體重總體呈上升趨勢，在第7、14 天時稱重，與對照組相比，CB 組體重分別提高了5.79%和3.97%，但差異均不顯著（P ＞0.05）。CB 組小鼠沒有發生腹瀉及死亡。試驗結果表明，給小鼠飼喂CB，不影響其生長性能。

表1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響

2.2 丁酸梭菌對小鼠血清細胞因子含量的影響由圖1 可知，與對照組相比，CB 組小鼠血清細胞因子DAO、TNF-α 和IL-8 的含量無顯著變化（P＞0.05），但DAO 的含量有下降趨勢，降低了5.57%，而TNF-α 和IL-8 則與之相反，分別提高了12.41%和20.50%。在ETEC 攻毒后，CB 組DAO、TNF-α 及IL-8 的含量顯著降低，分別降低了13.81%、29.61%和37.29%（P ＜0.05）。試驗結果表明，ETEC 感染導致小鼠機體發生炎癥反應，促進機體產生促炎性細胞因子，但是CB 能夠降低ETEC 誘導的促炎性細胞因子的水平。

圖1 丁酸梭菌對小鼠血清細胞因子含量的影響

2.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達量的影響 由圖2 可知，與對照組相比，CB 組ZO-1 和occludin 表達量分別提高了40%和20%；與對照組相比，ETEC 組ZO-1 和occludin表達量分別降低61%和27%，差異均顯著（P ＜0.01，P ＜0.05）；與ETEC 組相比，CB+ETEC 組ZO-1 和occludin 表達量分別提高了184.61%和24.66%，差異均顯著（P ＜0.01，P ＜0.05）。試驗結果表明，ETEC 感染能夠導致小鼠回腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達量下降，但是CB 能夠逆轉ETEC 造成的緊密連接蛋白表達下降。

圖2 丁酸梭菌對小鼠回腸緊密連接蛋白相對表達量的影響

3 討論

3.1 丁酸梭菌對小鼠生長性能的影響 丁酸梭菌即丁酸梭狀芽孢桿菌，對多種抗生素具有較強的耐藥性，研究表明，其僅對新生霉素、萬古霉素、四環素等幾種抗生素敏感。且丁酸梭菌能夠抵抗飼料制粒過程中的高溫、高熱，以及耐受機體胃液、膽汁酸、消化酶等的作用。因此，我國當前已在畜牧生產中逐步推廣應用該新型益生菌（李玉鵬等，2017）。本研究結果表明，試驗全程，各組小鼠均沒有發生腹瀉，成活率為100%，在保證小鼠原有營養水平的同時，給小鼠灌胃適量的CB，不影響其生長性能，且沒有給小鼠的健康造成不良影響。

3.2 丁酸梭菌對小鼠血清細胞因子的影響 丁酸梭菌能夠分泌多種營養物質，既有直接的營養功能，又能夠激活動物機體免疫系統，增強機體免疫力，維持動物健康。炎癥反應是機體的一種自我保護，適度時能幫助機體清除病原體，但過度的炎癥反應則會對組織造成傷害，甚至能夠危及生命，因而，正常情況下機體的炎癥反應與抗炎癥反應是處于平衡狀態的（李玉鵬等，2017）。二胺氧化酶（DAO）是一種高活性的細胞內酶，處于動物小腸黏膜上層絨毛中，其活性與黏膜細胞的核酸及蛋白合成高度關聯，可以反映機體腸道中機械屏障的完整度和受損情況。腸屏障功能受損時，腸黏膜上皮細胞將釋放DAO 進入血液（Shu 等，2016）。因此，血清中的DAO 活性能夠在一定程度上反映上皮細胞黏膜的受損情況，常作為判斷腸道通透性改變的內源指標（Zhao 等，2014）。腫瘤壞死因子（TNF-α）也是評判動物機體發生炎癥反應的一個重要指標，入侵機體的外來病原體會刺激單核巨噬細胞產生TNF-α，然后誘導機體發生炎癥反應（Feng 等，2016；Liu等，2009）。機體產生適量的TNF-α 時，能夠促進損傷組織的修復，誘導腫瘤細胞凋亡，抵抗病毒感染等，且對免疫應答具有一定的調節作用，但過量產生時則會造成機體免疫平衡的紊亂（李海花等，2019）。作為機體炎性因子之一，IL-8 是一種較強的趨化性活性因子，與外來病原體等刺激物誘導的緊密連接蛋白表達的改變相關，在機體腸道發生的炎癥反應中具有重要作用（Rostami等，2013）。通常當機體腸道發生炎癥反應時，血清中TNF-α 以及IL-8 含量會顯著上升，因此，二者能在一定程度上反映動物機體的健康狀況（王柳懿等，2013）。研究表明，微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠降低小鼠血清中IL-6與TNF-α 含量（張琳等，2020）。本研究表明，給小鼠灌胃適量CB 后，血清中的TNF-α 以及IL-8 含量有上升趨勢，使小鼠處于免疫激活狀態，適度地提升了機體的免疫力，并且能夠降低ETEC 誘導的促炎性細胞因子的含量。

3.3 丁酸梭菌對小鼠腸道緊密連接蛋白相對表達量的影響 腸道屏障與功能性緊密連接蛋白密切相關，單層腸上皮細胞通過緊密連接蛋白結合形成腸道屏障，能夠有效阻止從腸腔進入血液的有害微生物、抗原和毒素（Séverine 等，2021）。緊密連接包括跨膜蛋白（封閉蛋白和閉合蛋白）以及各種被招募到頂外側膜的胞漿蛋白，如緊密連接蛋白ZO-1、ZO-2 和occludin 等，它們經細胞骨架影響細胞形態和信號傳遞（Heinemann 和Schuetz，2019），被公認為能夠調節上皮細胞旁通路并在腸道通透性中發揮重要作用（He 等，2019）。研究表明，內源性或外源性毒素引起的炎癥會導致腸道屏障功能障礙（He 等，2019），與本研究結果一致。研究表明，微囊化布拉迪酵母菌與微囊化糞腸球菌能夠提高小鼠結腸中緊密連接蛋白occludin 和claudin-1 的表達量，緩解小鼠急性潰瘍性結腸炎病癥（張琳等，2020）。給斷奶仔豬飼喂含丁酸梭菌的飼糧，能夠提高其腸道中緊密連蛋白ZO-1、ZO-2、occludin 和claudin-1 mRNA 水平的相對表達量，降低機體炎癥反應，改善腸道通透性，維護腸道上皮的完整性，有利于機體發揮腸道屏障功能（李海花等，2019；李玉鵬等，2017）。本研究表明，ETEC 感染能夠降低小鼠回腸中緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 表達，但是這種不利影響能夠被CB 部分逆轉。

4 結論

丁酸梭菌能夠調節小鼠機體的炎癥反應，維護機體的免疫平衡，且不影響小鼠的健康狀況。此外，丁酸梭菌能夠促進緊密連接蛋白ZO-1 和occludin 的表達，減輕由致病性大腸桿菌導致的機體損傷程度，改善其腸道健康狀況。