基于炮制與配伍探究四逆散在抑郁模型大鼠體內代謝成分的差異

張雅婷，蔡 皓*，段 煜，裴 科，王夢晴，于 慧，劉 鑫，宋健濤，段奕辰

基于炮制與配伍探究四逆散在抑郁模型大鼠體內代謝成分的差異

張雅婷1, 2，蔡 皓1, 2*，段 煜1, 2，裴 科3，王夢晴1, 2，于 慧1, 2，劉 鑫1, 2，宋健濤1, 2，段奕辰1

1. 南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫藥大學 國家教育部中藥炮制規范化及標準化工程研究中心，江蘇 南京 210023 3. 山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西 晉中 030619

研究炮制與配伍對四逆散中主要有效成分在抑郁模型大鼠血漿、膽汁、尿液及糞便中代謝成分的差異。建立慢性不可預期溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，造模結束后分別ig柴胡、白芍、柴胡-白芍藥對、四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物，并在連續ig 7 d后收集24 h尿液及糞便，再次ig收集血漿及膽汁。采用超高效液相色譜-四極桿飛行質譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術對血漿、膽汁、尿液及糞便樣本進行檢測，并結合PeakViewTM和MetabolitePilotTM軟件進行鑒定分析。依據代謝途徑和離子碎片信息，推測柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸以及甘草素在抑郁模型大鼠體內主要以原型、脫糖、脫氧、去甲基化、氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等形式存在。最終在柴胡組中鑒定了27種代謝產物，在白芍組中鑒定了30種代謝產物，在柴胡-白芍藥對組中鑒定了52種代謝產物，在四逆散組中鑒定了118種代謝產物，在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中鑒定了168個代謝產物。在抑郁模型大鼠體內，配伍前后的“單味藥-藥對-復方”和炮制前后的“生品-醋炙品”的代謝產物存在較大差異。即經醋炙及配伍后，14種主要活性成分的原型及其代謝產物的分布更為廣泛，且醋炙在一定程度上促進了某些成分參與肝腸循環，進一步為四逆散抗抑郁作用的藥效物質研究奠定基礎，同時也為闡明炮制與配伍機制提供科學依據。

四逆散；醋炙；配伍；代謝產物；UPLC-Q-TOF/MS；抗抑郁作用；慢性不可預期溫和應激；柴胡；白芍；柴胡皂苷a；柴胡皂苷b2；柴胡皂苷c；柴胡皂苷d；芍藥苷；芍藥內酯苷；苯甲酰芍藥苷；氧化芍藥苷；橙皮苷；橙皮素；柚皮苷；甘草苷；甘草酸；甘草素

中藥炮制是根據中醫藥理論，依照辨證施治用藥的需要和藥物的自身性質，以及調劑和制劑的不同要求，所采取的一項制藥技術。有關單味藥的炮制機制已有廣泛研究，大量單味藥的炮制內涵實質已被揭示。但“藥有個性之特長，方有合群之妙用”，中藥多以復方的形式給藥，《神農本草經》中就有“上藥一百二十種為君，主養命；中藥一百二十種為臣，主養性；下藥一百二十五種為佐使，主治病；用藥須合君臣佐使”的記載。復方用藥從多元的角度以“君臣佐使”為配伍原則，以“四氣五味”“升降浮沉”以及“歸經”為用藥的依據和規律，因此，復方配伍用藥是中醫臨床用藥的最大特點。故在開展中藥復方炮制配伍機制的研究中要以單味中藥的研究為基礎。而藥對是中藥配伍中的最小單元，組成簡單，但具備中藥配伍最基本的特點，是復方最小的組方單位。許多臨床上常用的經典藥對均出自不同的復雜復方，藥對研究既是連接單味藥與復雜復方之間的重要橋梁，更集中體現了復雜復方配伍的核心。因此，以藥對研究作為切入點可以更好地闡明復雜復方中藥味炮制前后的組方機制。

目前，對中藥炮制前后“單味藥-藥對-復方”3個層次的炮制機制研究思路大多是運用中藥化學和藥理學的技術手段從炮制和配伍前后主要藥效物質與量的改變以及藥效學的角度進行闡述，從一定程度上初步揭示了中藥炮制的內涵。而中藥成分十分復雜，現代研究表明，中藥均是通過與人體的相互作用而發揮療效，必須進入體內才是中藥的體內直接作用物質，而這樣的物質才有可能是有效物質基礎或有效成分[1-3]。中藥體內藥效物質是中藥藥性理論、中藥炮制機制、中藥配伍規律等中藥理論研究的標志物，是中藥深入研究的基石。因此，從體內代謝成分的角度探究中藥發揮藥效的物質基礎則更為科學、合理和有效[4]?；诖耍槍χ兴幣谥婆湮榈难芯楷F狀，本研究創新性的以多成分和多靶點的組方為中心，向內以“單味藥-藥對-復方”3個層次進行拆方研究，向外以“生品-醋炙品”2個層面進行對比研究。

四逆散由柴胡、白芍、枳實和炙甘草4味藥按1∶1∶1∶1的比例組成，最早記載于張仲景的《傷寒論》，具有疏肝解郁、和解表里的功效，目前臨床所用的抗抑郁方大多以此經典方為基礎[5-6]。方中的“柴胡-白芍”藥對常以君臣藥配伍于疏肝解郁類復方中[7-8]，而醋炙尤以增強疏肝解郁的功效[9-12]。因此，本實驗選取了四逆散中的柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）、柴胡皂苷b2（saikosaponin b2，SSb2）、柴胡皂苷c（saikosaponin c，SSc）、柴胡皂苷d（saikosaponin d，SSd）、芍藥苷、芍藥內酯苷（albiflorin，Alb）、苯甲酰芍藥苷（benzoylpaeoniflorin，Ben）、氧化芍藥苷（oxypaeoniflorin，Oxy）、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸及甘草素這14種主要抗抑郁活性成分為研究對象[13-20]，探究炮制與配伍對四逆散在抑郁模型大鼠體內代謝成分的差異，為四逆散發揮抗抑郁作用的有效物質基礎提供科學依據，并對炮制與配伍機制的闡明提供參考。

1 材料

1.1 動物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（200～220 g，SPF級），由南京市江寧區青龍山動物養殖場提供，生產許可證：SCXK（蘇）2017-0001。

整個實驗研究過程中的環境條件：濕度（50±10）%、溫度（22±2）℃，所有動物實驗遵循南京中醫藥大學實驗動物倫理委員會有關實驗動物管理和使用的規定，均符合3R原則。

1.2 儀器

UPLC系統，日本Shimadzu公司；Triple TOF 5600+串聯飛行時間質譜儀，美國AB Sciex公司；電噴霧離子源（ESI），Analyst?TF 1.6 software工作站數據采集軟件，美國AB Sciex公司；Intagral-3 Milli-Q超純水凈化系統，美國Millipore公司；數據采集所用軟件為Analyst?TF 1.6 software（AB Sciex，Foster City，CA）。

1.3 化學藥品、試劑及實驗用飲片

對照品SSa（質量分數＞99%，批號C-024-190605）、SSb2（質量分數＞99%，批號C-051-181206）、SSc（質量分數＞98%，批號C-025-181127）、SSd（質量分數＞98%，批號C-026-181218）、芍藥苷（質量分數＞98%，批號S-010-180416）、Alb（質量分數＞99%，批號S-011-181031）、Ben（質量分數＞99%，批號B-024-180719）、Oxy（質量分數＞98%，批號Q-019-181031）、甘草苷（質量分數＞98%，批號G-009-181216）、甘草酸（質量分數＞99%，批號G-004-181226）、甘草素（質量分數質量分數＞98%，批號G-036-180507）、橙皮苷（質量分數＞93%，批號C-006-190904）、橙皮素（質量分數＞98%，批號C-017-181129）以及柚皮苷（質量分數＞98%，批號Y-006-170426）均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供。實驗過程中使用的甲醇（HPLC/MS級）和乙腈（HPLC/MS級）均購自德國Merck公司。甲酸（UPLC級，質量分數99%）購自美國Anaqua化學公司。其他試劑（分析級）均購自南京化學試劑股份有限公司。米醋購自海天食品股份有限公司，生產批號20190312。

實驗用飲片均購自安徽銅陵禾田中藥飲片有限公司，其中柴胡飲片原產于甘肅（生產批號20180601）、白芍飲片原產于安徽（生產批號20180611）、枳實飲片原產于江西（生產批號20190129）、炙甘草飲片原產于內蒙（生產批號20180731），經南京中醫藥大學江蘇省中藥炮制重點實驗室蔡皓副研究員鑒定為正品，分別為傘形科柴胡屬植物柴胡DC.的干燥根（，BR），毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根（，PRA），蕓香科柑橘屬植物酸橙L.的干燥幼果（，AFI），豆科甘草屬植物甘草Fisch. ex DC.的干燥根和根莖的炮制加工品（etcum，GRRPM）。

采用《中國藥典》2020年版（四部）炮制通則所述方法制備醋炙柴胡（vinegar-processed BR，vpBR）和醋炙白芍（vinegar-processed PRA，vpPRA）飲片：取柴胡及白芍生品若干，撿出雜質后，按1 kg飲片用0.2 kg米醋充分混合，拌勻悶潤，置炒炙容器中，以文火加熱不停翻炒，炒干為度，取出，放涼后備用。

2 方法

2.1 供試品提取液的制備

稱取飲片若干（柴胡、白芍、枳實、炙甘草質量比為1∶1∶1∶1），用蒸餾水回流提?。?倍量蒸餾水提取1.5 h），濾過，殘渣再用蒸餾水回流提?。?倍量蒸餾水提取1 h），濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至最終質量濃度為0.96 g/mL（以飲片干質量計），制得四逆散水提液。

稱取飲片若干（醋炙柴胡、醋炙白芍、枳實、炙甘草質量比為1∶1∶1∶1），操作方法同上，制得含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散水提液。

稱取飲片若干（柴胡、白芍質量比為1∶1），操作方法同上，制得柴胡-白芍藥對水提液。

分別稱取柴胡飲片和白芍飲片若干，操作方法同上，分別制得柴胡水提液和白芍水提液。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取SSa、SSb2、SSc、SSd、芍藥苷、Alb、Ben、Oxy、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸及甘草素對照品適量，用甲醇配制成質量濃度分別為88.96、94.72、78.48、88.80、81.28、87.60、86.56、81.92、82.88、38.24、76.40、82.96、38.68、39.08mg/mL的混合對照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF/MS檢測條件

2.3.1 色譜檢測條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫程序：0.01～5 min，5%～30%乙腈；5～7 min，30%～65%乙腈；7～15 min，65%～95%乙腈；15～17 min，95%乙腈；17～19 min，95%～5%乙腈；19～21 min，5%乙腈；體積流量0.3 mL/min；進樣量1 μL；柱溫40 ℃。

2.3.2 質譜檢測條件 離子化模式為電噴霧正、負離子模式（ESI+/?），離子噴霧電壓（ion spray voltage floating，ISVF）分別為5500 V/?4500 V，離子源溫度為550 ℃，去簇電壓（declustering potential，DP）分別為60 V/?60 V，碰撞能量（collision energy，CE）分別為45 V/?45 V，碰撞能量擴展（collision energy spread，CES）為20 V。噴霧輔助氣體為氮氣（N2），霧化氣（nebulizer gas，Gas1）和輔助加熱氣（heater gas，Gas2）的壓力均設定為379.212 kPa（55 psi），氣簾氣（curtain gas，Cur）為241.316 kPa（35 psi）。一級質譜母離子掃描范圍為/100～2000，子離子掃描范圍為/50～1000。

2.4 動物實驗

2.4.1 慢性不可預期溫和應激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁癥大鼠模型的建立 CUMS模型造模周期為4周，刺激方式[21]：（I）晝夜顛倒12 h，（II）禁食24 h，（III）禁水24 h，（IV）水平震蕩15 min，（V）捆綁束縛6 h，（VI）潮濕籠子12 h，（VII）鼠籠傾斜12 h，（VIII）夾尾1 min，（IX）4 ℃冰水游泳5 min，（X）異物暴露12 h，（XI）異味刺激5 h，（XII）噪音干擾5 h。各組大鼠（除正常組外）于每天8:00、20:00時由抽簽選取一種刺激方式進行造模，注意3 d以內刺激方式不重復。

2.4.2 模型的行為學評價指標 造模結束后，通過體質量變化指標、糖水偏好實驗、曠場實驗、強迫游泳實驗進行行為學評價。

2.4.3 生物樣品的采集 造模結束后，分別ig生理鹽水（正常組及模型組）和各給藥組提取物，給藥劑量為9.6 g/kg，給藥體積為10 mL/kg。每天1次，連續給藥7 d后，收集24 h的尿液和糞便。所有大鼠分別再次給藥，并于給藥后40 min眼眶取血于預先涂有1%肝素鈉的EP管中，3500 r/min離心15 min，取上清，得到血漿，將其置于?80 ℃儲存備用。同時進行膽管插管，收集4 h膽汁，?80 ℃保存，備用。

2.4.4 生物樣品供試液的制備

（1）血漿：精密吸取血漿300 μL，置1.5 mL EP管中，加入甲醇900 μL，渦旋5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進樣。

（2）膽汁：精密吸取膽汁300 μL，置4 mL EP管中，加入甲醇3 mL，從中取50 μL于1.5 mL EP管中，加入950 μL甲醇，渦旋5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進樣。

（3）尿液：精密吸取尿液300 μL，置10 mL EP管中，加入甲醇5 mL，渦旋5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進樣。

（4）糞便：將每只大鼠的全部糞便烘干6 h后粉碎，精密稱取碾碎混勻的糞便1 g，加入甲醇4 mL，溶解勻漿，13 000 r/min離心5 min，取上清于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進樣。

2.5 數據采集與分析

在分析鑒定化合物之前，建立柴胡、白芍、枳實和炙甘草的14種化學成分數據庫，包括名稱、CAS號、分子式、相對分子質量及其化學結構（mol：化學分子結構文件）文件等化學成分信息。體內柴胡、白芍、枳實及炙甘草原型成分的相關信息由軟件Analyst?TF 1.6分析及鑒定，然后使用PeakViewTM軟件的XIC Manager功能進行鑒別，以保留時間（誤差范圍在0.2 min以內）和質荷比（/）（誤差范圍在1.0×10?5之內）這2個參數初步確定化合物。再結合化合物在裂解過程中的一級離子碎片、二級離子碎片信息，以及匹配率（大于75%）共同確定各個離子峰的歸屬，從而完成原型化合物的最終鑒別。其次，體內柴胡、白芍、枳實及炙甘草代謝產物成分的相關信息由軟件Metabolite PilotTM分析及鑒定，將在PeakViewTM軟件中匹配分析所得到的原型成分的信息錄入Compound Library，并進行代謝途徑庫和分析方法的建立，最終根據綜合評分的匹配度（大于75%）共同確定體內代謝產物的最終鑒別。

3 結果

3.1 CUMS大鼠模型評價

通過對體質量變化、糖水偏好值、曠場實驗的活動總路程、中央停留時間及活動總次數、強迫游泳實驗的水中靜止不動時間等指標進行評價后的整體評價結果顯示：造模后大鼠自主活動能力下降，對經歷快樂的能力缺失，對于在危機時的求生欲望也顯著降低，造模成功。

3.2 給藥后血漿、膽汁、尿液、糞便的UPLC-Q-TOF/MS分析

將模型組的血漿、膽汁、尿液、糞便和給藥組的血漿、膽汁、尿液、糞便樣品進行UPLC-Q-TOF/MS分析，正、負離子模式下的總離子流圖見圖1。

M-模型組 SNP-四逆散組 POS-正離子模式 NEG-負離子模式

3.2.1 原型成分的結構鑒定 經PeakViewTM軟件處理，結果見表1。ig柴胡提取物后，未在抑郁模型大鼠體內檢測到柴胡皂苷原型成分。ig柴胡-白芍藥對提取物后，在抑郁模型大鼠的糞便中檢測到原型成分。ig四逆散提取物后，未檢測到原型成分。ig含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，在抑郁模型大鼠的糞便中檢測到柴胡皂苷原型成分。ig白芍提取物后，在抑郁模型大鼠體內檢測到白芍總苷原型成分，其中芍藥苷和Alb在血漿、膽汁、尿液及糞便中均能被檢測到，Oxy在膽汁及糞便中被檢測到，Ben僅在糞便中被檢測到。ig柴胡-白芍藥對提取物后，同樣能在膽汁和糞便中檢測到Oxy，在膽汁、尿液及糞便中檢測到芍藥苷和Alb，但在血漿中并未檢測到這2個化合物的原型成分，也并未在大鼠體內檢測到Ben。ig四逆散提取物后，僅在大鼠血漿和尿液中檢測到芍藥苷和Alb。ig含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，在血漿、膽汁、尿液及糞便中均能檢測到芍藥苷和Alb，在血漿、膽汁及糞便中均能檢測到Oxy。ig四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，枳實中的橙皮苷、橙皮素及柚皮苷均在體內被檢測到，其中含醋炙品的四逆散給藥后在血漿中未檢測到柚皮苷，在尿液中未檢測到橙皮苷。ig四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，炙甘草中的甘草苷、甘草素均在體內被檢測到，四逆散含醋炙品前后對甘草酸的體內代謝影響較大，甘草酸在給藥四逆散提取物后未在體內被檢測到，而給藥含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，在體內的血漿、膽汁、尿液及糞便中均能檢測到其原型。整體來看，四逆散中主要活性成分的原型均能在大鼠體內被檢測到，但各成分主要經糞便、膽汁及尿液代謝。其中含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中所檢測到的原型成分最多，且在血漿中的含量占比較高，符合前期藥動學研究的結果。

表1 炮制與配伍前后四逆散主要活性成分在抑郁模型大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的分布情況

3.2.2 與柴胡相關的代謝產物 柴胡皂苷類成分的代謝產物見表2。ig后，在抑郁模型大鼠體內共鑒定出與SSa、SSb2、SSc、柴胡皂苷d相關的代謝產物33種。在柴胡組中檢測到27種，其中23種成分在糞便中以I相代謝物形式存在，3種成分在膽汁中以II相代謝物形式存在，僅有1種成分在血漿中以I相代謝物形式存在；在柴胡-白芍藥對組中檢測到29種，其中26種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，3種成分在血漿及膽汁中以II相代謝物形式存在；在四逆散組中檢測到19種，其中18種成分在糞便中以I相代謝物形式存在，11種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，8種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測到28種，其中25種成分在糞便中以I相代謝物形式存在，11種成分在膽汁中以I、II相代謝物形式存在，10種成分在血漿中以I相代謝物形式存在。柴胡皂苷類成分的代謝產物基本上均在血漿、膽汁、糞便中出現，在體內主要發生的代謝類型以I相代謝中脫糖、去甲基化、氧化和II相代謝中甲基化、與葡萄糖醛酸結合為主。

表2 炮制與配伍前后柴胡的柴胡皂苷類成分在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝物

3.2.3 與白芍相關的代謝產物 白芍總苷類成分的代謝產物見表3。ig后，在抑郁模型大鼠體內共鑒定出與芍藥苷、Alb、Ben、Oxy相關的代謝產物57種。在白芍組中檢測到30種，其中20種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，17種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，6種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，3種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在柴胡-白芍藥對組中檢測到23種，其中10種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，5種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，2種成分在血漿中以II相代謝物形式存在，1種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在四逆散組中檢測到30種，其中13種成分在血漿中以I、II相代謝物形式存在，10種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，6種成分在尿液中以I相代謝物形式存在，4種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測到36種，其中24種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，17種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，4種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，3種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在。白芍總苷類成分的代謝產物在血漿、膽汁、尿液、糞便中均有出現，在體內主要發生的代謝類型以I相代謝中脫糖、脫氧、氫化、氧化和II相代謝中甲基化、與葡萄糖醛酸結合為主。

續表3

3.2.4 與枳實相關的代謝產物 橙皮苷、橙皮素、柚皮苷的代謝產物見表4。ig后，在抑郁模型大鼠體內共鑒定出與橙皮苷、橙皮素、柚皮苷相關的代謝產物65種。在四逆散組中檢測到33種，其中21種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，17種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，13種成分在膽汁中以I、II相代謝物形式存在，12種成分在糞便中以I相代謝物形式存在；在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測到65種，其中40種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，33種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，24種成分在血漿中以I、II相代謝物形式存在，21種成分在膽汁中以I、II相代謝物形式存在。橙皮苷、橙皮素、柚皮苷的代謝產物在血漿、膽汁、尿液、糞便中均有出現，在體內主要發生的代謝類型以I相代謝中氧化、去甲基化、氧化、脫糖、脫氧、去羥基亞甲基化和II相代謝中與葡萄糖醛酸結合、與硫酸結合、甲基化為主，其中一些代謝產物未經I相代謝而直接參與到II相代謝，在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中被檢測到。

表4 四逆散中的柴胡和白芍醋炙前后枳實的橙皮苷、橙皮素和柚皮苷在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝物

續表4

3.2.5 與炙甘草相關的代謝產物 甘草苷、甘草酸、甘草素的代謝產物見表5。ig后，在抑郁模型大鼠體內共鑒定出與甘草苷、甘草酸、甘草素相關的代謝產物43種。在四逆散組中檢測到36種，其中25種成分在血漿中被檢測到，20種成分在糞便中被檢測到，18種成分在尿液中被檢測到，8種成分在膽汁中被檢測到，均以I、II相代謝物形式存在。在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測到39種，其中23種成分在糞便中被檢測到，21種成分在尿液中被檢測到，19種成分在血漿中被檢測到，18種成分在膽汁中被檢測到，均以I、II相代謝物形式存在。甘草苷、甘草酸、甘草素的代謝產物在血漿、膽汁、尿液、糞便中均有出現，在體內主要發生的代謝類型以I相代謝中脫糖、脫氧、去甲基化、氧化、氫化和II相代謝中與葡萄糖醛酸結合、與硫酸結合、甲基化為主，其中基本上全部的代謝產物均未經I相代謝而直接參與到II相代謝。

表5 四逆散中的柴胡和白芍醋炙前后炙甘草的甘草苷、甘草酸和甘草素在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝物

續表5

4 討論

SSa、SSb2、SSc和SSd為“君藥”柴胡中的主要成分，芍藥苷、Alb、Ben和Oxy為“臣藥”白芍中的主要成分，橙皮苷、橙皮素和柚皮苷為“佐藥”枳實中的主要成分，甘草苷、甘草酸和甘草素為“使藥”炙甘草中的主要成分。課題組前期研究結果顯示，炮制及配伍對四逆散中這14種主要有效成分在抑郁模型大鼠體內的藥動學狀態有顯著的影響。本研究首次基于炮制與配伍的角度對四逆散進行拆方研究，實驗結果顯示，炮制及配伍前后各成分在CUMS抑郁模型大鼠體內的存在形式有較大差異。其中，柴胡皂苷類成分在體內主要進行I相代謝，在腸道中水解并以苷元的形式吸收入血，在體內檢測到其代謝產物是以苷元的去甲基化、氧化等形式存在，并最終由糞便排出。這與之前的研究結果[22]不太一致，推測可能與疾病狀態對藥物體內代謝的影響有關[23-28]。

與單味藥柴胡組相比，經柴胡與白芍配伍后組方的四逆散組以及經柴胡與白芍炮制后再配伍組方的含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的柴胡皂苷類代謝產物的分布更加廣泛，且近一半的代謝物在血漿和膽汁中被檢出。目前已有相關報道指出，柴胡經醋炙后部分成分發生了量變和質變，其中揮發油的含量降低，而與解熱和抗炎相關的9種藥效成分含量升高，并產生16種新成分，同時有10種成分消失[29]。推測可能是由于炮制及配伍后成分的變化促使某些代謝物的產生以及反應位點和代謝進程發生了改變；含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的代謝產物主要經糞便和膽汁進行代謝，提示柴胡經醋炙后促進了某些成分參與肝腸循環，進一步為“醋炙發揮肝臟引經作用”提供了佐證。

白芍總苷類成分在體內主要以原型和I、II相代謝產物形式存在，原型在體內廣泛分布，代謝產物主要在糞便和尿液中被檢測到。各組間的代謝產物分布規律較為相似，但原型的分布有較大差異，其中Ben的原型僅在單味藥白芍組中被檢測到以糞便排出，炮制及配伍后的各組均未檢測到其原型。前期研究時發現Ben的生物利用度偏低，而此次實驗證實，在ig給藥后其在體內可迅速代謝脫去1個C7H4O并進而主要轉化為芍藥苷，因此，導致其血藥濃度偏低。有學者對大鼠ig Ben后Ben和芍藥苷的藥動學行為進行研究，結果未檢測到Ben的原型，同時推測Ben以入血后代謝為芍藥苷，發揮功效作用[30]。進一步提示炮制及配伍可促進Ben向芍藥苷的代謝轉化，進而在一定程度上增強了抗抑郁療效的發揮。此外，Oxy的原型除了在四逆散組中未見有檢出外，在其余各組的膽汁及糞便中均有分布。推測產生這一現象的原因可能是由于在加入枳實和炙甘草的配伍組方四逆散后抑制了某些代謝物的產生，或是與配伍后成分間的相互作用有關，尚有待進一步的探討。

枳實中的橙皮苷、橙皮素和柚皮苷主要以原型和I、II相代謝產物形式廣泛存在于體內，與四逆散組相比，含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中這3個成分的代謝途徑更廣，代謝產物更豐富，其中大多數代謝產物在體內不經I相反應而直接進行II相代謝。炙甘草中的甘草苷、甘草酸和甘草素同樣以原型和I、II相代謝產物形式存在于體內，四逆散組和含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組的代謝產物分布規律相似，但原型的分布差異顯著，尤以甘草酸最為明顯。甘草酸的原型成分在四逆散中未檢測到，而在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的血漿、膽汁、尿液及糞便中均被檢測到。甘草酸在體內易代謝產生大量的甘草次酸[31]，進一步對四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的甘草次酸的原型成分分析時發現，甘草次酸廣泛存在于這兩組的血漿、膽汁、尿液及糞便中?？梢娝哪嫔⒃诤写字似非昂髮Ω什菟岬捏w內代謝有較大的影響。

綜上所述，在CUMS抑郁模型大鼠體內，這14種主要抗抑郁有效成分的體內代謝物在“單味藥-藥對-復方”和“生品-醋炙品”不同層次的分析中存在顯著差異?？傮w來看，相比于其他組，含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測到的代謝產物的種類較多且在體內分布的范圍較廣，這些差異可能與其在治療抑郁病癥發揮效應相比于其他各組更具優勢的主要原因之一。

本實驗根據中藥體內代謝成分的研究思路，首次應用UPLC-Q-TOF/MS分析炮制與配伍后四逆散中主要活性成分在抑郁模型大鼠體內的代謝成分。同時基于成分鑒定的相關軟件和數據庫的建立，并依據代謝途徑和離子碎片信息，推測SSa、SSb2、SSc、SSd、芍藥苷、Alb、Ben、Oxy、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸以及甘草素在CUMS抑郁模型大鼠體內主要以原型、脫糖、脫氧、去甲基化、氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等形式存在。并鑒定了柴胡中的27種代謝物、白芍中的30種代謝物、柴胡-白芍藥對中的52種代謝物、四逆散中的118種代謝物以及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散中的168種代謝物。

在CUMS抑郁模型大鼠體內，配伍前后的“單味藥-藥對-復方”和炮制前后的“生品-醋炙品”的原型及其代謝產物存在差異，即經醋炙及配伍后，14種主要活性成分的原型及其代謝產物的分布更為廣泛，且醋炙在一定程度上促進了某些成分參與肝腸循環，進一步為四逆散抗抑郁作用的藥效物質研究奠定基礎，同時也為闡明炮制與配伍機制提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Investigation on difference of metabolites of Sini Powder in the depressive rats based on processing and compatibility

ZHANG Ya-ting1, 2, CAI Hao1, 2, DUAN Yu1, 2, PEI Ke3, WANG Meng-qing1, 2, YU Hui1, 2, LIU Xin1, 2, SONG Jian-tao1, 2, DUAN Yi-chen1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. School of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To investigate the differences of the metabolites of the main effective constituents contained in Sini Powder (四逆散, SNP) in plasma, bile, urine, and feces of depressive rats by processing and compatibility.The depressive rat model was established by chronic unpredictable mild stress (CUMS). After modeling, the extracts of Chaihu (, BR), Baishao (, PRA), the herb-pair of-(BR-PRA), SNP, and SNP containing vinegar-processed(vpBR) and vinegar-processed(vpPRA) were ig administered, respectively. Urine and feces for 24 h were collected after continuously intragastric administration for seven days, and plasma and bile were collected after intragastric administration again. The technique of ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) was applied to detect the samples of plasma, bile, urine, and feces, and PeakViewTMand MetabolitePilotTMsoftwares were used for identification and analysis.According to the metabolic pathway and ion fragment information, it was speculated that saikosaponin a, saikosaponin b2, saikosaponin c, saikosaponin d, paeoniflorin, albiflorin, benzoylpaeoniflorin, oxypaeoniflorin, hesperidin, hesperetin, naringin, liquiritin, glycyrrhizic acid, and liquiritigenin were mainly metabolizedto prototype, deglycosylation, deoxidation, demethylation, oxidation, methylation, glucuronidation, sulfation, and other forms in depressive rats. Finally, 27, 30, 52, 118, and 168 metabolites were identified in the BR group, the PRA group, the BR-PRA herb-pair group, the SNP group, and the group of SNP containing vpBR and vpPRA, respectively.There were large differences in metabolites between the “individual herb-herb pair-herbal formula” before and after compatibility and the “crude products-vinegar-processed products” before and after processing in depressive rats. That is to say, the prototypes and metabolites of 14 main active constituents had more extensive distribution after vinegar-processing and compatibility, and vinegar-processing promoted the participation of some constituents in hepatoenteral circulation to a certain extent, which further laid the foundation for investigating the antidepressant substantial basis of SNP, and also provide the scientific evidence for clarifying the mechanism of processing and compatibility.

Sini Powder; vinegar-processing; Chinese medicinal formula compatibility; metabolites; UPLC-Q-TOF/MS; antidepressant effect; chronic unpredictable mild stress;;; saikosaponin a; saikosaponin b2;saikosaponin c; saikosaponin d; paeoniflorin; albiflorin; benzoylpaeoniflorin; oxypaeoniflorin; hesperidin; hesperetin; naringin; liquiritin; glycyrrhizic acid; liquiritigenin

R283.6

A

0253 - 2670(2021)23 - 7244 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.019

2021-05-25

國家自然科學基金面上項目（81673600）；江蘇省研究生科研創新計劃（KYCX20_1604）；江蘇省研究生科研創新計劃（KYCX18_1637）

張雅婷（1995—），女，碩士，從事中藥質量控制及中藥炮制與中藥復方臨床功效的相關性研究。Tel: (025)86798281 E-mail: zhangyatingzyt@126.com

蔡 皓（1966—），男，副研究員，碩士生導師，從事中藥質量控制及中藥炮制與中藥復方臨床功效的相關性研究。Tel: (025)86798281 E-mail: haocai@njucm.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]