基于特征圖譜、化學計量學和分子對接的復方阿膠漿質量標志物研究

許 嘯，張 淹，任雪陽，王 宇，董 英，宋若蘭，于啊香，魏 靜，馬嘉慕，折改梅*

基于特征圖譜、化學計量學和分子對接的復方阿膠漿質量標志物研究

許 嘯1，張 淹2，任雪陽1，王 宇1，董 英1，宋若蘭1，于啊香1，魏 靜1，馬嘉慕1，折改梅1*

1. 北京中醫藥大學中藥學院，北京 102488 2. 山東東阿阿膠股份有限公司國家膠類中藥工程技術研究中心，山東 聊城 252201

以質量標志物（quality markers，Q-Marker）“五原則”為指導，結合特征圖譜、化學計量學、分子對接和含量測定等技術，開展復方阿膠漿（Fufang E’jiao Jiang，FEJ）治療貧血癥的Q-Marker研究。色譜柱Agilent Zorbax SB AQ-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%甲酸乙腈溶液-0.1%甲酸水溶液，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長330 nm，焦地黃苯乙醇苷A1為參照峰，建立FEJ特征圖譜。采用層次聚類分析（hierarchical clustering analysis，HCA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least square method-discriminant analysis，PLS-DA）對不同批次FEJ進行分析。查閱《中國藥典》和文獻，結合組方配伍環境（君、臣、佐使）、成分傳遞與溯源等多因素，收集篩選質量控制6個關鍵成分。在GEO數據庫中檢索篩選貧血癥（anemia）的差異基因，采用Discovery Studio 2016 v16.1軟件，將成分與貧血癥相關靶點進行對接驗證。以330、270 nm雙波長同時測定FEJ中異毛蕊花糖苷和黨參炔苷的含量。FEJ特征圖譜中指認了咖啡酸、綠原酸、洋地黃葉苷C、阿魏酸、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、異毛蕊花糖苷共8個特征成分。HCA、PCA和PLS-DA將16批FEJ分為3類，其中異毛蕊花糖苷、洋地黃葉苷C和焦地黃苯乙醇苷A1對FEJ質量影響最為顯著。8個特征成分和6個關鍵成分的分子對接結果表明，異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、毛蕊花糖苷4個成分能夠與激肽原-1（kininogen-1，KNG1）、泛素樣蛋白ISG15（ubiquitin-like protein ISG15，ISG15）、賴氨酸特異性脫甲基酶6A（lysine-specific demethylase 6A，KDM6A）、乙?；竸恿Φ鞍?3（dynamin-3，DNM3）、蛋白酶激活受體2（proteinase-activated receptor 2，F2RL1）、半胱氨酰白三烯受體1（cysteinyl leukotriene receptor 1，CYSLTR1）6個靶蛋白通過氫鍵、疏水鍵、π-π鍵等作用力結合，具有較好的活性，可作為FEJ的Q-Marker。16批樣品中異毛蕊花糖苷、黨參炔苷質量濃度分別為6.05～12.30、9.14～16.30 μg/mL。建立了FEJ特征圖譜，結合化學計量學和分子對接等技術，篩選了4個Q-Marker異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、毛蕊花糖苷、綠原酸，并建立了異毛蕊花糖苷、黨參炔苷的含量測定方法，為FEJ質量控制提供參考。

復方阿膠漿；質量標志物；特征圖譜；化學計量學；分子對接；貧血癥；層次聚類分析；主成分分析；偏最小二乘法-判別分析；質量控制；咖啡酸；綠原酸；洋地黃葉苷C；阿魏酸；焦地黃苯乙醇苷A1；毛蕊花糖苷；焦地黃苯乙醇苷B1；異毛蕊花糖苷

復方阿膠漿（Fufang E’jiao Jiang，FEJ）包括阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂共5味中藥。原方出自明代《景岳全書》中“兩儀膏”，按照“氣血互生，氣升血長”的中醫理論加味而成。臨床常用于氣血兩虛、頭暈目眩、心悸失眠、食欲不振及白細胞減少癥和貧血等癥[1]?！吨袊幍洹?020年版FEJ質量標準重點關注了阿膠的真偽和優劣。在中醫理論中，氣血相關理論與治療血管生成相關?，F代藥理研究表明，血管新生是涉及多種細胞如內皮細胞和血管平滑肌細胞的多步驟復雜生物過程，是相關細胞因子、細胞外基質等與細胞之間相互作用的結果。在缺血刺激下，新的血管和側支循環會逐漸生成，達到改善缺血的目的[2-3]。文獻報道，斑馬魚模型可用于研究血管生成[4-5]、微血管功能[6]等方面。本課題組前期研究發現FEJ的促血管生成活性優于單味藥阿膠。因此紅參等4味植物來源中藥對FEJ功效有很重要的貢獻，質量標準應該對其予以關注。

2016年，劉昌孝院士[7-8]提出了中藥質量標志物（quality marker，Q-Marker）這一中藥質量評價與質量控制的核心概念，“五原則”從質量傳遞與溯源、成分特有性、成分的有效性、成分可測性以及復方配伍環境5個方面，貫穿并指導了中藥Q-Marker的研究與發現[9]。中藥特征圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，能夠反映中藥多成分特點，已被廣泛應用于中藥及中藥復方制劑的質量控制[10-11]。將化學計量學方法如層次聚類分析（hierarchical cluster analysis，HCA）、主成分分析（principal components analysis，PCA）法、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discrimination analysis，PLS-DA）等用于特征圖譜的數據分析可以更為有效的挖掘信息。有文獻報道[12-14]，采用HCA分類結果，結合PCA和PLS-DA得到各成分的貢獻率，從而挖掘造成組間差異的主要成分。這些成分可以作為Q-Marker的候選成分。

但是由于特征圖譜中實驗條件（如供試品制備方法、檢測波長等）的局限，存在不能全部體現化學成分信息的問題。這個也會影響到潛在Q-Marker的選擇，或者會造成潛在Q-Marker的丟失。因此，本研究又通過查閱《中國藥典》2020年版和參考文獻，整理得到FEJ各藥味中活性成分，并從中藥組方的配伍環境（君、臣、佐、使）、成分的傳遞和溯源等方面對各單味藥材飲片進行分析，從而有效地彌補特征圖譜成分信息不全，獲取質量控制的關鍵成分。從而滿足Q-Marker五原則的質量傳遞與溯源、成分特有性以及復方配伍環境等特征。

分子對接技術是以結構分子生物學和計算機輔助藥物設計相結合的方式，通過將配體與受體進行對接，評價其對接體系的穩定性，篩選與受體活性部位空間和電性特征相匹配的小分子化合物。該技術不僅周期短，操作性強，而且還避免了藥理實驗穩定性差的缺點，已經逐漸成為中藥活性成分篩選的重要手段[15-16]。本研究利用分子對接技術，對FEJ中的特征成分和關鍵成分進行治療貧血癥的活性篩選，從多種角度探索藥物與疾病的關聯，同時確保了所選Q-Marker的有效性。最后，以Q-Marker為指標成分，建立FEJ中熟地黃、黨參的多成分含量測定方法，為FEJ Q-Marker可測性提供了依據。該研究科學合理地提升了FEJ的質量標準，彌補了以總氮量為唯一含量測定方法。本研究的技術路線如圖1。

圖1 FEJ Q-Marker研究的技術路線

1 儀器與材料

1.1 儀器

華譜科儀Acchorm S6000高效液相色譜儀，配備在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器，華譜科儀（北京）科技有限公司；BT25S型十萬分之一電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司；MX-S型渦旋振蕩器，北京大龍興創實驗儀器有限公司；3-18N型高速離心機，湖南恒諾儀器設備有限公司；8302型恒溫水浴鍋，上海利浦自動化儀表廠。

1.2 材料與試劑

FEJ（批號1905075、1907011、1907012、1907014、1907015、1907017、1907020、1907021、1907022、1909004、1909007、1909010、1909011、1909013、1909015、1909016，編號依次對應為S1～S16），以及批號為1905075批次所對應的紅參藥材（批號201812-001）、黨參藥材（批號201905-002）、熟地黃藥材（批號201905-005）、山楂藥材（批號201905-002）、紅參陰性樣品、黨參陰性樣品、熟地黃陰性樣品、山楂陰性樣品，均由東阿阿膠股份有限公司提供。對照品咖啡酸（批號110885-200102）、綠原酸（批號110753-200413）、阿魏酸（批號110773-201915），購于中國食品藥品檢定研究院；對照品焦地黃苯乙醇苷A1（批號DST190902-070）、毛蕊花糖苷（批號DST190422-061）、異毛蕊花糖苷（批號DST200513-060）、焦地黃苯乙醇苷B1（批號DST201203-071）、洋地黃葉苷C（批號DST201109-057），購于成都德思特生物技術有限公司；對照品黨參炔苷（批號PRF9121002），購自成都普瑞法科技開發有限公司；以上所有對照品的質量分數均≥95%。甲醇、乙腈為色譜級，美國Fishier Scientific公司，其余試劑均為分析純。超純水由實驗室Millipore Synergy超純水系統自制。

2 方法與結果

2.1 FEJ HPLC特征圖譜

2.1.1 色譜條件 Agilent Zorbax SB-AQ C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%甲酸乙腈溶液為流動相A，以0.1%甲酸水溶液為流動相B，梯度洗脫程序：0～20 min，2%～5% A；20～35 min，5%～12% A；35～45 min，12%～14% A；45～55 min，14%～20% A；55～65 min，20%～23% A；65～80 min，23%～35% A；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長330 nm；進樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密量取FEJ 2 mL，加入乙腈6 mL，渦旋至充分混勻，離心，取上清液，殘渣加入乙腈6 mL，渦旋至充分混勻，離心，合并上清液，蒸干，殘渣加30%甲醇溶解，并轉移至1 mL量瓶中，加30%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 對照品溶液的制備 取咖啡酸、綠原酸、洋地黃葉苷C、阿魏酸、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、異毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成分別含咖啡酸20 μg/mL、綠原酸20 μg/mL、洋地黃葉苷C 50 μg/mL、阿魏酸20 μg/mL、焦地黃苯乙醇苷A150 μg/mL、毛蕊花糖苷20 μg/mL、焦地黃苯乙醇苷B150 μg/mL、異毛蕊花糖苷50 μg/mL的混合溶液，即得混合對照品溶液。

2.1.4 精密度試驗 取編號為S1的FEJ（批號1905075），按“2.1.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰峰面積。以焦地黃苯乙醇苷A1為參照峰，各共有峰的相對峰面積RSD均小于1.70%，相對保留時間RSD均小于0.05%，表明儀器精密度良好。

2.1.5 重復性試驗 取編號為S1的FEJ（批號1905075）6份，按“2.1.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積。以焦地黃苯乙醇苷A1為參照峰，各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.99%，相對保留時間RSD均小于0.03%，表明方法重復性良好。

2.1.6 穩定性試驗 取編號為S1的FEJ（批號1905075），按“2.1.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件，分別在0、2、4、6、8、16、24 h進樣，記錄峰面積。以焦地黃苯乙醇苷A1為參照峰，各共有峰的相對峰面積RSD均小于2.08%，相對保留時間RSD均小于0.09%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7 HPLC特征圖譜的生成與相似度評價 取16批FEJ（S1～S16），按“2.1.2”項下方法制得供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣。采用《中藥指紋圖譜相似度評價評價系統（2012A版）》對所記錄圖譜的AIA文件進行分析。以S1為參照圖譜，時間窗寬度設為0.2 min，對色譜峰進行多點校正和全峰匹配，生成16批FEJ的特征圖譜匹配圖以及對照指紋圖譜，見圖2。

其中，5號峰焦地黃苯乙醇苷A1分離度好，保留時間居中，選擇其為參照峰，計算S1～S16特征圖譜與對照特征圖譜的相似度，結果分別為0.998、0.994、0.996、0.998、0.998、0.997、0.998、0.994、0.993、0.998、0.997、0.994、0.989、0.991、0.996、0.997，均大于0.9，表明各批次樣品的化學成分穩定。

圖2 16批FEJHPLC特征圖譜 (S1～S16) 及其對照特征圖譜(R)

2.1.8 共有峰的歸屬與指認 根據對照品共指認出8個化合物，1～8號共有峰分別為咖啡酸、綠原酸、洋地黃葉苷C、阿魏酸、焦地黃苯乙醇苷A1、毛蕊花糖苷、焦地黃苯乙醇苷B1、異毛蕊花糖苷，結果見圖3。

取FEJ（批號1905075）及對應批次的單味藥材飲片，按“2.1.2”項制得紅參、黨參、熟地黃、山楂的供試品溶液和FEJ供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別進樣。通過查閱各味中藥成分文獻報道及各成分對照品色譜和光譜圖，對FEJ特征圖譜色譜峰進行歸屬，見圖4。結果顯示，1號峰咖啡酸為黨參[17]、熟地黃[18-19]中的共有成分；2號峰綠原酸為紅參[20-21]、山楂[22]中的共有成分；3號峰洋地黃葉苷C[23]為熟地黃中的成分；4號峰阿魏酸為黨參、熟地黃中的共有成分；5號峰焦地黃苯乙醇苷A1、6號峰毛蕊花糖苷、7號峰焦地黃苯乙醇苷B1、8號峰異毛蕊花糖苷為熟地黃中的成分[23-24]。

1-咖啡酸 2-綠原酸 3-洋地黃葉苷C 4-阿魏酸 5-焦地黃苯乙醇苷A1 (S) 6-毛蕊花糖苷 7-焦地黃苯乙醇苷B1 8-異毛蕊花糖苷

供試品溶液制備時使用乙腈沉淀了蛋白，因而在此色譜條件所得的HPLC特征圖譜中暫無共有峰來自阿膠。

2.2 化學模式分析

2.2.1 HCA 采用Origin 2019軟件進行分析，運用組間連接法，Euclidean距離為測度，以FEJ特征圖譜中的8個特征峰峰面積為觀測量，繪制聚類分析圖，見圖5。16批樣品分成3大類：S1～S4為第1類，S5～S11為第2類、S12～S16為第3類，說明不同批次的合格藥材所生產的產品含量存在一定差異，此可能與飲片的原藥材來源、飲片的加工等過程有關。

2.2.2 PCA和PLS-DA 為了進一步分析造成不同批次樣品之間差異的化學成分，以樣品S1～S16為變量，8種成分的峰面積為變量，利用SIMCA 14.1軟件進行PCA和PLS-DA處理，結果見圖6。將16批樣品分為3類，以PLS-DA模型中重要性投影（VIP）值＞1.0篩選不同批次樣品間的差異性成分，VIP值的大小表明了對樣品分類的貢獻程度。結果顯示，PCA和PLS-DA共得到3個成分，分別為8號峰異毛蕊花糖苷、5號峰焦地黃苯乙醇苷A1和3號峰洋地黃葉苷C，表明這3種成分是影響不同批次樣品之間質量差異貢獻較大的特征成分。提示在FEJ整個生產過程中可重點監控這3個成分，減小批次間的差異性，為FEJ Q-Marker的選定提供參考。

2.3 分子對接驗證

2.3.1 基于GEO數據庫的貧血癥的靶點篩選 《中國藥典》2020年版中，FEJ功能主治為“補氣養血”，常用于治療氣血兩虛、白細胞減少癥和貧血等癥。“氣血兩虛”在傳統中醫理論中涉及多個臟腑的氣血陰陽失調，在西醫中并無對應的病癥，但從臨床表現來看，以貧血癥和慢性疲勞綜合征的臨床癥狀與其類似[25]。因此對貧血癥進行下一步研究。

在GEO數據庫中進行基因表達譜芯片篩選，以“anemia normal”為關鍵詞、實驗以人源作為樣本，得到基因表達譜芯片GSE32719。利用R軟件及aggy、limma、pheatmap等R軟件包，對芯片進行表達值背景矯正和表達譜數據的歸一化預處理，包括原始數據格式的轉換，缺失值補充，背景矯正及用數據標準化；以|logFC|≥1且＜0.05為篩選條件，選擇統計學檢驗后差異最為顯著的基因作為研究對象，獲取貧血癥正常組與實驗組差異表達基因，并將探針名轉化為標準基因名。

圖4 紅參、黨參、熟地黃、山楂與FEJ供試品溶液的HPLC圖

圖5 16批FEJ的HCA圖

結果得到貧血癥相關658個差異基因，其中，以logFC呈現正值為上調基因463個，列出調控最顯著的前20位差異基因；以logFC呈現負值為下調基因有195個，列出調控最顯著的前20位差異基因并繪制差異基因火山圖和熱圖，見圖7。

圖6 16批FEJ的PLS-DA模型及VIP值

2.3.2 蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡的構建及拓撲分析 將上述得到的差異基因導入String平臺（https://string-db.org），選擇“multiple proteins”模式，蛋白種屬設為“Home sapiens”，篩選條件為最低相互作用閾值取“highest confidence（≥0.9）”構建PPI網絡，見圖8。網絡中節點（node）表示靶點蛋白，邊（edge）表示蛋白與蛋白之間的相互作用，共涉及536個節點和232條邊。平均節點度值為0.866 6，平均局部聚類系數為0.225。PPI網絡富集的值為0.007 47，表明該網絡具有顯著的相互作用。

圖7 貧血癥差異表達基因火山圖(A)和熱圖(B)

圖8 PPI網絡圖

將PPI數據結果以*.tsv格式導出，導入Cytoscape 3.7.2軟件，利用CytoNCA 2.1.6插件進行網絡拓撲分析，計算靶點拓撲參數包括網絡節點度（degree centrality，DC）、介數中心度（betweenness centrality，BC）和緊密度（closeness centrality，CC），運用-score函數［-score＝[－mean()]/std()，其中，代表拓撲參數值，mean()為平均數，std()為標準差］進行標準化處理，將標準化處理后的拓撲參數值相加。度、緊密度和介數可以用于評價節點在網絡中的中心性和重要性，節點的度、緊密度和介數越高，節點在交互網絡中的重要性越高[26]。

選擇排名前20的靶點作為貧血癥的關鍵靶點，各靶點特征參數見表1。

2.3.3 關鍵靶點（靶蛋白）信息的收集與前處理 選取貧血癥差異基因中排名前10的關鍵靶點，在PDB數據庫（http://www. rcsb.org）中搜索并下載靶蛋白的三維結構，選擇來源為人源（human）、解析度小（＜0.3 nm）、X-Ray解析的晶體結構作為研究對象。將靶蛋白導入Discovery Studio 2016 v16.1軟件中，利用Clean Protein模塊和Prepare Protein模塊對靶蛋白進行刪除多余蛋白質構象、刪去水分子、補全不完整殘基、加氫等蛋白預處理。選擇靶蛋白特有的小分子配體作為活性中心，刪除位于活性口袋位置的配體小分子（原配體），暴露活性口袋并將其定義為對接體系中受體分子。

表1 貧血癥靶點特征參數

2.3.4 原配體對接驗證 將靶蛋白中的原配體單獨提取，基于靶蛋白中的原配體的活性口袋位點，利用CDocker模塊，將原配體對接到對應的活性口袋中，計算靶蛋白中原配體的分子構象與對接后的分子構象的均方根偏差（RMSD）。若RMSD＜0.20 nm，則說明對接所得分子構象可以在一定程度上還原配體與受體的結合模式，從而證明所選擇的對接方法與參數設置具有合理性，結果見表2。得到靶蛋白KNG1、ISG15、KDM6A、DNM3、F2RL1、CYSLTR1，這些靶蛋白的RMSD均小于0.2 nm，說明所選擇的對接方法及參數設置合理，可以用于下一步與成分對接。

2.3.5 成分信息的收集與前處理 復方制劑藥味組成繁雜，化學成分眾多，某些成分在特征圖譜的單一檢測波長下吸收較弱，難以體現。因此，通過查閱《中國藥典》和相關文獻，對紅參、熟地黃、黨參、山楂中可能成為Q-Marker的成分進行收集篩選，擴充FEJ Q-Marker的選擇。篩選得到紅參、熟地黃、黨參、山楂中的關鍵成分人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、黨參炔苷、枸櫞酸、毛蕊花糖苷。同時結合特征圖譜研究中得到的8個特征成分，最終整理得到13個成分進行分子對接驗證。

表2 靶點活性口袋信息及計算結果

在PubChem數據庫中搜索并下載成分的2D結構，保存為.sdf格式。將結構導入Discovery Studio 2016 v16.1軟件中，利用Prepare Ligands模塊對小分子配體進行加氫、產生三維結構和異構體等預處理，并利用Minimize Ligands模塊賦予CHARMm力場進行能量最小化。

2.3.6 成分與關鍵靶點（靶蛋白）對接 利用Discovery Studio 2016 v16.1軟件的CDocker模塊，將潛在活性成分對接到處理好的活性口袋中。SDS Site Sphere半徑根據原配體對接情況設定，Top Hit設為10，Pose Cluster Radius設為0.5，其他參數設置為默認值，對接打分值選取-cdocker interaction energy值。對接打分值評價成分與靶點的相互作用，CDocker Energy值越低（即-cdocker interaction energy值越高），則說明化學成分與蛋白受體對接體系越穩定，對接結果越可靠[27]，其成為活性成分可能性越高。以原配體與靶蛋白對接后的對接打分值作為閾值，選取對接打分值大于閾值的成分作為FEJ治療貧血癥的活性成分，最終得到8個對接打分值大于閾值的成分，結果見表3。

分子對接結果表明，異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、毛蕊花糖苷等成分與各個靶點均有較好的結合，對接打分值較高。其中，異毛蕊花糖苷與靶蛋白DNM3和6RZ5的對接打分值最高；黨參炔苷與靶蛋白KDM6A的對接打分值最高；綠原酸與靶蛋白F2RL1對接打分值最高；毛蕊花糖苷與靶蛋白ISG15對接打分值最高。說明異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、毛蕊花糖苷4個成分對貧血癥靶點能夠較好地作用于貧血癥靶點，可作為FEJ治療貧血癥的活性成分。

表3 活性成分的對接打分值

進一步分析活性成分與靶蛋白的相互作用，以異毛蕊花糖苷與靶蛋白DNM3為例分析成分與靶蛋白之間的相互作用，見圖9。圖中左側為成分與靶蛋白對接圖，中間為配體與受體結合處相互作用3D圖，右側為配體與受體結合處相互作用2D圖。

異毛蕊花糖苷結合于DNM3的蛋白RBD空腔中，與DNM3的關鍵氨基酸SER41、ASP208、ASN236、SER238、LYS206、GLY43、SER45、LYS44、ARG237發生氫鍵作用，與LEU209、VAL64發生疏水作用。結合的關鍵氨基酸殘基有酸性氨基酸殘基ASP208和堿性氨基酸殘基LYS44、ARG237，可形成氫鍵或鹽橋，構成一個具有可成藥性的潛在活性位點，從而發生相互作用。

圖9 異毛蕊花糖苷與靶蛋白DNM3的相互作用

通過分子對接技術，對質量控制中的特征成分和關鍵成分進行活性驗證，得到異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、毛蕊花糖苷4個成分可作為FEJ的Q-Marker。其中，綠原酸在山楂、熟地等多個藥味中均有，專屬性差。毛蕊花糖苷在FEJ中含量很低，含量測定難度高。異毛蕊花糖苷是熟地黃的專屬性成分，黨參炔苷是黨參的專屬性成分。這兩個成分可溯性和有效性良好。因此將Q-Marker異毛蕊花糖苷和黨參炔苷作為指標成分，進行FEJ含量測定研究。

2.4 FEJ多成分含量測定

2.4.1 色譜條件 Thermo hypersil gold C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.1%甲酸乙腈溶液為流動相A，以0.1%甲酸水溶液為流動相B梯度洗脫，梯度洗脫程序：0～15 min，2%～20% A；15～30 min，20% A；30～35 min，20%～22% A；35～40 min，22%～25% A；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長330、270 nm；進樣量10 μL。

2.4.2 供試品溶液的制備 精密量取FEJ 2 mL，加入乙腈6 mL，渦旋至充分混勻，離心，取上清液，殘渣加入乙腈6 mL，渦旋至充分混勻，離心，合并上清液，蒸干，殘渣加30%甲醇溶解，并轉移至1 mL量瓶中，加30%甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。同法制得熟地黃陰性樣品溶液和黨參陰性樣品溶液。

2.4.3 對照品溶液的制備 取異毛蕊花糖苷、黨參炔苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含異毛蕊花糖苷25 μg/mL、黨參炔苷50 μg/mL的混合溶液，即得對照品溶液。

2.4.4 線性關系考察 取異毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加甲醇制成含有異毛蕊花糖苷0.484 mg/mL的對照品溶液。取黨參炔苷對照品適量，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加甲醇制成含有黨參炔苷0.478 mg/mL的對照品溶液。分別精密量取異毛蕊花糖苷對照品溶液和黨參炔苷對照品溶液2.5 mL，配制成混合對照品溶液。取混合對照品溶液，用甲醇分別稀釋0、2、5、10、50倍，配制成系列質量濃度的混合對照品溶液，分別進樣。以質量濃度（）對色譜峰面積（）繪制標準曲線，進行線性回歸，得2種成分回歸方程分別為異毛蕊花糖苷＝14 533－1 357.8，＝0.999 6，線性范圍4.84～242.00 μg/mL；黨參炔苷＝10 026＋1 3224，＝0.999 6，線性范圍4.78～239.00 μg/mL。

2.4.5 專屬性試驗 對異毛蕊花糖苷和黨參炔苷的混合對照品溶液、FEJ供試品溶液（批號1905075），以及批號1905075 FEJ所對應的熟地黃陰性樣品和黨參陰性樣品進行測定。

通過雙波長檢測，在330 nm下檢測異毛蕊花糖苷，在270 nm下檢測黨參炔苷。結果表明，檢測波長330 nm下熟地黃陰性樣品對FEJ供試品中異毛蕊花糖苷的測定無干擾；檢測波長270 nm下黨參陰性樣品對FEJ供試品中黨參炔苷的測定無干擾，見圖10，說明該方法專屬性強。

2.4.6 精密度試驗 取FEJ樣品（批號1905075），按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，連續進樣6次，測定異毛蕊花糖苷和黨參炔苷，結果各成分峰面積的RSD分別為0.86%、0.87%，滿足精密度限度（RSD）為6%[28]，表明儀器精密度良好。

圖10 FEJ供試品(a)、混合對照品(b)、陰性對照溶液(c) 在檢測波長330 nm (A) 和270 nm (B) 下的HPLC圖

2.4.7 重復性試驗 取FEJ樣品（批號1905075），按“2.4.2”項下方法制備6份供試品溶液，測定異毛蕊花糖苷和黨參炔苷，結果各成分峰面積的RSD分別為2.01%、2.01%，滿足重復性限度（RSD）為6%[28]，表明方法重復性良好。

2.4.8 穩定性試驗 取FEJ樣品（批號1905075），按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣，測定異毛蕊花糖苷和黨參炔苷，結果各成分峰面積的RSD分別為1.68%、1.67%，表明24 h內，供試品溶液穩定性良好。

2.4.9 加樣回收試驗 取FEJ樣品（批號1905075）6份，每份1 mL，按照接近1∶1的量計算所要添加的2種成分的對照品，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，依法提取測定，計算各成分的回收率。結果表明，異毛蕊花糖苷和黨參炔苷的平均回收率分別為101.13%、103.19%，RSD分別為2.71%、2.90%，滿足回收率限度為80%～115%[28]，表明方法的準確度良好。

2.4.10 樣品測定結果 取16個批次（S1～S16）的FEJ，每個批次平行制備3份供試品溶液，依次進樣測定，結果見表5。16批FEJ中異毛蕊花糖苷和黨參炔苷的質量濃度分別在6.05～12.30 μg/mL、9.14～16.30 μg/mL。

表4 FEJ中異毛蕊花糖苷和黨參炔苷含量測定結果(, n = 3)

3 討論

3.1 FEJ Q-Marker的選擇及分析

隨著中醫藥學的飛速發展，中成藥的普及性和應用性越來越廣。2016年劉昌孝院士[7-8]提出了中藥Q-Marker概念，形成了中藥產品質量控制的新理念。從生源途徑、化學物質基礎、炮制加工過程、藥效研究和中醫理論等多個層面，密切關聯了中藥的物質基礎、有效性和質量控制，為全面提升中藥質量標準提供理論和方法的支持[29-30]。

本研究從特征圖譜中指認了8個成分，保證Q-Marker的特有性和可溯性?；瘜W計量學分析提示了異毛蕊花糖苷、洋地黃葉苷C和焦地黃苯乙醇苷A1這3個成分應被重點關注，為Q-Marker篩選提供參考。本研究通過查閱《中國藥典》和相關文獻，對紅參、熟地黃、黨參、山楂中可能成為Q-Marker的成分進行收集篩選，擴充FEJ Q-Marker的選擇。紅參和熟地黃是組方中的臣藥。其中《中國藥典》2020年版中使用人參皂苷Rb1、Re、Rg1作為紅參指標成分，將這些指標成分納入到后續研究中。黨參和山楂是組方中的佐使藥。黨參能夠提高造血機能、抗疲勞、增強機體免疫力等，其主要活性成分黨參炔苷[31-33]?！吨袊幍洹?020年版收載了黨參以黨參炔苷為對照的薄層鑒別方法，專屬性好，因此選定黨參炔苷進一步研究。同時將山楂含量測定的指標成分枸櫞酸納入后續研究中。

分子對接技術作為一種快速的活性驗證方法，已被廣泛應用于藥材飲片、中藥復方等活性成分的篩選和驗證中[34-35]。分子對接結果顯示，異毛蕊花糖苷、黨參炔苷、綠原酸、毛蕊花糖苷4個成分是FEJ治療貧血癥的活性成分，可作為Q-Marker。

結合化合物來源的專屬性以及含量可測性等因素，選定異毛蕊花糖苷和黨參炔苷為FEJ的Q-Marker。這2個成分傳遞和溯源明確、具有活性且專屬性強，整體滿足中藥Q-Marker的五原則特征。

3.2 提取條件考察

FEJ的制備工藝采用紅參、黨參、熟地黃、山楂水煎煮的提取方法，化學成分組成復雜且多為大極性化合物。實驗前期，在特征圖譜和含量測定的供試品制備中，考察了不同提取溶劑，包括甲醇、乙醇、醋酸乙酯-正丁醇、乙腈對FEJ進行提取，以及不同溶解定容溶劑，包括水及30%、70%、100%甲醇對FEJ上清液殘渣進行溶解。研究表明使用甲醇作為提取溶劑時，影響部分成分的提取，且基線不穩定；使用乙醇提取，色譜峰多，分離度差；使用醋酸乙酯-正丁醇（1∶1）和乙腈提取后，色譜峰分離度較好。由正丁醇沸點高，回收難度，因此采用乙腈提取的方法進行制備。此外，研究發現不同溶解溶劑對色譜峰影響差異不明顯，其中30%甲醇復溶的色譜峰分離度較好，因此選用30%甲醇作為復溶溶劑。同時，優化了提取溶劑的體積和提取次數，保證含量測定中FEJ供試品能夠被提取完全。

3.3 色譜條件考察

本研究對特征圖譜和含量測定中的檢測波長、流動相組成等色譜條件進行優化。在特征圖譜研究中，利用二極管陣列檢測器在190～400 nm在線掃描，記錄并比較了不同波長下的特征圖譜。在203 nm下檢測到人參皂苷Rg1，然而由于響應值低（含量少，推測可能與復方中紅參用量少有關），基線噪音影響較大，因此未選用203 nm作為檢測波長。通過查閱文獻以及DAD掃描顯示，黨參炔苷的最大吸收波長在270 nm左右[38]，在檢測波長270 nm下，色譜圖顯示前15 min受干擾嚴重，苯乙醇苷類成分反映不完整，因此未選用270 nm作為檢測波長。在含量測定研究方法中，330 nm下色譜峰響應值和各峰峰高比例較好，色譜峰數目較多且分離度較好。黨參炔苷在330 nm下紫外吸收極弱，因此，未在特征圖譜中對其進行指認。綜上，最終確定330 nm為檢測波長。

本研究考察了5種流動相體系，包括乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、0.05%甲酸乙腈-0.05%甲酸水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水。結果表明，當0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相體系時，共有峰峰型良好，分離度好，且以甲酸水溶液為水相時可以進一步改善各成分峰的峰形，效果最佳。此外，本實驗也考察了不同柱溫（25、30、35 ℃），不同體積流量（0.6、0.8、1.0 mL/min），結果發現，當柱溫為30 ℃、體積流量為1.0 mL/min，檢測波長為330 nm時，所得色譜峰的數目較多、峰形及分離度等方面均表現良好。

在含量測定研究中，利用二極管陣列檢測器在190～400 nm在線掃描，得到異毛蕊花糖苷對照品在327 nm左右波長下有最大吸收；黨參炔苷對照品在268 nm左右波長下有最大吸收。最終選定在檢測波長330 nm下測定異毛蕊花糖苷，在檢測波長270 nm下測定黨參炔苷。對FEJ特征圖譜的洗脫條件進行優化，在保證成分達到分離效果的同時，縮短檢測時間。在該流動相洗脫條件下，異毛蕊花糖苷和黨參炔苷出峰情況良好，分離度達到要求。

本研究提供了一種FEJ中Q-Marker研究的創新思路與方法，提升了FEJ質量控制水平。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 1322-1323.

[2] 金永志, 李夢帆, 黃榮, 等. 當歸補血湯促進血管新生作用的研究進展 [J]. 中醫藥導報, 2019, 25(13): 109-111,117.

[3] 陳榮榮, 郭浩, 徐硯通, 等. 中藥復方和有效成分對血管新生促進或抑制作用的研究進展 [J]. 中草藥, 2013, 44(23): 3413-3421.

[4] 史永平, 劉發生, 孔浩天, 等. 利用斑馬魚模型研究丹紅注射液及代表性成分的促進血管生成作用 [J]. 時珍國醫國藥, 2019, 30(11): 2588-2590.

[5] 王成, 龔莉虹, 郭朝成, 等. 模式生物斑馬魚在中藥藥效物質篩選中的應用進展 [J]. 中草藥, 2019, 50(24): 6125-6134.

[6] 陳維武, 白瑪卓瑪, 郭勝亞, 等. 二十五味珍珠片對斑馬魚微血管功能的影響 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2019, 25(13): 49-54.

[7] 劉昌孝, 陳士林, 肖小河, 等. 中藥質量標志物(QMarker): 中藥產品質量控制的新概念 [J]. 中草藥, 2016, 47(9): 1443-1457.

[8] Liu C X, Cheng Y Y, Guo D A,. A new concept on quality marker for quality assessment and process control of Chinese medicines [J]., 2017, 9(1): 3-13.

[9] 張鐵軍, 白鋼, 陳常青, 等. 基于“五原則”的復方中藥質量標志物(Q-marker)研究路徑 [J]. 中草藥, 2018, 49(1): 1-13.

[10] 彭平, 熊少哲, 張蓓, 等. 基于全方特征圖譜質量表征的芩連制劑質量評價研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(5): 1312-1322.

[11] 許春芳, 崔莉莉, 鄢紅霞, 等. 昆仙膠囊HPLC特征指紋圖譜和多成分定量測定研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(24): 6213-6220.

[12] 張夢晨, 謝輝, 陸兔林, 等. 基于指紋圖譜、化學計量學、網絡藥理學的半夏湯洗前后質量評價 [J]. 中草藥, 2021, 52(10): 2897-2908.

[13] 高森, 王蘋, 唐鋮, 等. 基于HPLC指紋圖譜、多指標成分含量測定及化學計量學的濕熱痹片質量評價 [J]. 中草藥, 2020, 51(21): 5454-5461.

[14] 陳曉璐, 郭振旺, 鄧家剛, 等. 基于肉桂質量標志物(Q-Marker)預測的質量控制研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(9): 2707-2718.

[15] 李志立, 楊冰, 翟艷敏, 等. 基于分子對接技術虛擬篩選紅花中抗心肌缺血活性組分 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(12): 2881-2890.

[16] 王玉, 楊雪, 靳曉杰, 等. 基于中醫藥整合藥理學平臺、GEO數據庫芯片及分子對接探討大黃抗肝癌的作用機制 [J]. 中草藥, 2020, 51(20): 5207-5219.

[17] 凈晶, 張吉發, 李慧, 等. 長花黨參化學成分的研究 [J]. 時珍國醫國藥, 2013, 24(10): 2340-2342.

[18] 馮蓬, 甘東浩, 王衛國, 等. 基于網絡藥理學的熟地黃干預骨質疏松癥分子機制研究 [J]. 山東中醫雜志, 2020, 39(2): 177-184.

[19] Tao J H, Zhao M, Ling Y,. UPLC-Q-TOF/MS-based metabolic profiles of bioactive components inandherb pair by rat intestinal bacteria [J]., 2017, 9(2): 147-152.

[20] Ali M B, Hahn E J, Paek K Y. CO2-induced total phenolics in suspension cultures ofC. A. Mayer roots: Role of antioxidants and enzymes [J]., 2005, 43(5): 449-457.

[21] Chung I M, Lim J J, Ahn M S,. Comparative phenolic compound profiles and antioxidative activity of the fruit, leaves, and roots of Korean ginseng (Meyer) according to cultivation years [J]., 2016, 40(1): 68-75.

[22] 趙博, 田恒康, 孫道涵, 等. 基于酚類特征圖譜的山楂質量表征關聯分析研究 [J]. 北京中醫藥大學學報, 2017, 40(8): 684-692.

[23] 鄒獻亮, 陳颋, 華臘, 等. 一測多評法同時測定熟地黃中4種苯乙醇苷 [J]. 中成藥, 2019, 41(5): 1085-1090.

[24] Shen L J, Chen H L, Zhu Q F,. Identification of bioactive ingredients with immuno-enhancement and anti-oxidative effects from Fufang-Ejiao-Syrup by LC-MSncombined with bioassays [J]., 2016, 117: 363-371.

[25] 張萬年. 益氣安神膏治療氣血兩虛型慢性疲勞綜合征的臨床研究 [D]. 廣州:廣州中醫藥大學, 2018.

[26] 馬婧, 陳茜, 邊亞倩, 等. 基于系統中藥學的丹參活血化瘀功效標志物研究 [J]. 中國中藥雜志, 2020, 45(14): 3259-3265.

[27] 劉美鳳, 蔣利榮, 劉華鼐, 等. 番石榴葉抗Ⅱ型糖尿病活性成分的虛擬篩選 [J]. 華南理工大學學報: 自然科學版, 2011, 39(3): 28-31.

[28] 中國藥典 [S]. 四部. 2020: 480-483.

[29] 彭任, 陸兔林, 胡立宏, 等. 中藥飲片質量標志物(Q-marker)研究進展 [J]. 中草藥, 2020, 51(10): 2603-2610.

[30] 陳麗華, 肖發林, 黃詩雨, 等. 中藥質量評價研究思路及創新發展趨勢 [J]. 中草藥, 2021, 52(9): 2541-2547.

[31] 廖江敏, 李林玉, 瞿云安, 等. 黨參藥材活性成分黨參炔苷的化學穩定性研究 [J]. 天然產物研究與開發, 2020, 32(3): 385-388.

[32] Zhang P, Hu L H, Bai R B,. Structural characterization of a pectic polysaccharide fromand its immunomodulatory activitiesand[J]., 2017, 104(Pt A): 1359-1369.

[33] Zhao X N, Hu Y L, Wang D Y,. The comparison of immune-enhancing activity of sulfated polysaccharidses fromand[J]., 2013, 98(1): 438-443.

[34] 龔曼, 楊聯河, 朱利利, 等. 鄂西香茶菜甲素作為抗腫瘤先導物的發現與抗腫瘤活性驗證 [J]. 中國中藥雜志, 2021, 46(16): 4061-4068.

[35] 郭錦晨, 王莖, 孫宇潔, 等. 基于網絡藥理學及分子對接探討桑葉-菊花治療高血壓的作用機制 [J]. 天然產物研究與開發, 2021, 33(5): 847-858.

[36] 鄭昆, 倫志彩, 羅兆亮. 超高效液相色譜-波長切換法同時測定健脾丸(濃縮丸)中4種成分的含量 [J]. 食品與藥品, 2021, 23(2): 142-146.

Study of quality markers of Fufang E’jiao Jiang based on characteristic spectrum, chemometrics and molecular docking

XU Xiao1, ZHANG Yan2, REN Xue-yang1, WANG Yu1, DONG Ying1, SONG Ruo-lan1, YU A-xiang1, WEI Jing1, MA Jia-mu1, SHE Gai-mei1

1. School of Chinese Pharmacy, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China 2. National Engineering Research Center for Gelatin-based Traditional Chinese Medicine, Dong-E-E-Jiao Co., Ltd., Liaocheng 252201, China

Guided by the “Five Principles” of quality markers (Q-Marker), combined with characteristic spectrum, chemometrics and molecular docking and content determination, developed Q-Marker for the treatment of anemia with Fufang E'jiao Jiang (復方阿膠漿, FEJ).The characteristic spectrum of FEJ was determined by HPLC using Agilent Zorbax SB AQ-C18column. The mobile phase was 0.1% formic acid acetonitrile-0.1% formic acid water, and the flow rate was 1.0 mL/min, detection wavelength was 330 nm. Sixteen batches of FEJ characteristic spectrum were established with jionoside A1as the reference peak. Based on the results of common peak area determination of characteristic spectrums, the quality of different batches of FEJ was evaluated by hierarchica cluster analysis (HCA), principal components analysis (PCA) and partial least squares-discrimination analysis (PLS-DA). Six key components were collected from each herb inand literatures. The differential genes of anemia was searched in the GEO database, and Discovery Studio software was used to verify the components in FEJ. The content of two components in 16 batches was determined at the same time at 330 nm and 270 nm.There were eight components were identified, namely caffeic acid, chlorogenic acid, purpureaside C, ferulic acid, jionoside A1, acteoside, jionoside B1, isoacteoside. The results of HCA, PCA and PLS-DA showed that 15 batches of FEJ can be divided into three categories. Isoacteoside, purpureaside C, and jionoside A1were contributing to the quality difference between different batches of FEJ. The results of molecular docking showed that isoacteoside, lobetyolin, chlorogenic acid, and acteoside can bind to six key targets such as KNG1, ISG15, KDM6A, DNM3, F2RL1, and CYSLTR1 through hydrogen bonds, hydrophobic bonds, π-π bonds, etc. They can be used as Q-Markers of FEJ. The contents of isoacteoside and lobetyolin in 16 batches of FEJ were 6.05—12.30 μg/mL and 9.14—16.30 μg/mL, respectively.Q-Markers in FEJ was explored by characteristic spectrum, chemometrics and molecular docking, which can be used for quality control and evaluation of FEJ.

Fufang E’jiao Jiang; quality markers (Q-Markers); characteristic spectrum; chemometrics; molecular docking; anemia; hierarchical cluster analysis; principal components analysis; partial least squares-discrimination analysis; quality control; caffeic acid; chlorogenic acid; purpureaside C; ferulic acid; jionoside A1; acteoside; jionoside B1; isoacteoside

R283.6

A

0253 - 2670(2021)23 - 7148 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.009

2021-06-16

國家重點研發計劃（2018YFC1707300）；國家重點研發計劃項目（2018YFC1706300）

許 嘯（1995—），女，碩士研究生，研究方向為中（民族）藥藥效成分和新藥創制研究。Tel: 13521701679 E-mail: xux_26@163.com

折改梅（1976—），女，研究員，博士生導師，研究方向為中（民族）藥藥效成分和新藥創制研究。Tel: (010)53912129 E-mail: shegaimei@126.com

[責任編輯 鄭禮勝]