HPLC法測定阿托伐他汀鈣中間體B-4的相關物質

朱鎮星，覃松，馬密茸，李翠杰，歐陽曉輝(浙江宏元藥業股份有限公司，浙江 臨海 317016)

0 引言

阿托伐他汀鈣[1-2]，商品名LIPITOR，分子結構式由式(1)表示，是HMG-CoA還原酶的選擇性、競爭性抑制劑，通過抑制肝臟內HMG-CoA還原酶和膽固醇的合成從而降低血漿中膽固醇和脂蛋白水平，并通過增加細胞表明的肝臟LDL受體以增強LDL的攝取和代謝；適用于高膽固醇血癥和冠心病，是全球第1個年度銷售額超過百億美元的重磅新藥。

B-4，分子結構式由式(2)表示，化學名：2-[2-(4-氟苯基)-2-氧代-1-苯基乙基]-4-甲基-3-氧代-N-苯基戊酰胺；英文名稱：2-[2-(4-Fluorophenyl)-2-oxo-1-phenylethyl]-4-methyl-3-oxo-Nphenylpentanamide. CAS號：125971-96-2,是合成阿托伐他汀鈣原料藥的關鍵中間體[3-5], 化學結構如下。

B-4主要控制的雜質有工藝雜質去氟B-4雜質，分子結構式由式(3)表示；前一步中間體B-3，分子結構式由式(4)表示。B-4樣品的乙腈溶液在玻璃進樣小瓶中，發生無法預測的，貌似隨機的降解。問題的詭異之處在于每個樣品溶液制備時，均無法預測樣品是否會降解，隨著時間推移，回顧已經制備的樣品溶液，在HPLC玻璃進樣瓶中的溶液穩定性，約10%的溶液顯示會降解，12 h內降解0.2%～2%。我們通過研究確定溶液降解是由堿催化引起B-4降解，降解雜質為B-4的烯醇式結構[6]，分子結構式由式(5)表示，相關文獻中未報到B-4的烯醇式雜質。

本次研究的意義在于：阿托伐他汀鈣是十分重要的降低膽固醇的藥物，B-4為阿托伐他汀鈣關鍵中間體，開發一個耐用性良好，能夠避免HPLC玻璃進樣瓶的堿性物質催化降解的B-4相關物質檢測方法，對阿托伐他汀鈣原料藥的質量控制具有重要意義。同時，避免放行過程中不必要的OOS(超標)調查，對于提高QC實驗室數據完整性合規性具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司) ，色譜柱：Agela XBP-C18 150 mm×4.6 mm，5 μm，XPE-105型電子天平(瑞士梅特勒公司)。

1.2 試藥與對照品

B-4樣品(批號：191003)，B-4對照品(批號：20200222)含量99.7%，去氟B-4雜質(批號：20200621)含量98.9%，B-3雜質(批號：20201118)含量99.1%。純化水(超純水)：乙腈(色譜級，德國默克公司)，磷酸(色譜級，德國默克公司)，碳酸氫鈉(分析級)，HPLC玻璃進樣瓶(Agilent 部件號：5182-0716，批號17306794，17171251，17278167，18283373)。

2 降解雜質調查實驗

2.1 B-4降解雜質情況說明

日常檢測發現RRT1.13(降解圖譜中12.019 min，正常圖譜如圖2所示)有個未知峰，在不同的HPLC玻璃進樣瓶中的樣品溶液，檢測結果詭異，沒有規律性，色譜檢測中也叫鬼峰[7]或者異常峰[8]。

圖1 降解圖譜

圖2 正常圖譜

2.2 B-4降解雜質調查

取其中一個異常批B-4(批號：191003，RRT1.13雜質檢測結果2.2%)進行復測調查，原進樣瓶的復測結果為2.5%(放置進樣瓶時間延長，雜質增大)，原容量瓶和重新新鮮配制均為0.0%，說明未知雜質來源于HPLC玻璃進樣瓶(調查復測結果如表1所示)。

表1 調查復測結果

通過查閱文獻，發現關于HPLC玻璃進樣瓶的原因導致樣品降解出現鬼峰的報道：例如，進樣瓶內表面含有硝化物雜質，使氯法齊明(Clofazimine)在酸性條件下，氧化反應生成未知雜質氯法齊明亞硝酸酯(Clofazimine nitrite ester)[9]；依折麥布(Ezetimeble)的純乙腈樣品溶液在某個特定的玻璃進樣瓶中，由堿催化引起依折麥布降解形成二種二聚雜質和依折麥布異構體[10]；另外，在文獻“The importance of vial composition in HPLC analysis: an unusual case of phosphorous pseudorotation.”中報道，索非布韋(Sofosbuvir)50%的乙腈水稀釋的樣品溶液在進樣瓶中溶液不穩定，當稀釋液改為乙腈：0.1%磷酸水溶液，樣品溶液在HPLC玻璃進樣瓶中穩定性良好[11]。

隨機取4個不同批次由安捷倫生產的玻璃進樣瓶，測定pH值(取20個進樣瓶，用純化水超聲潤洗，測定清洗液的pH)，再隨機取各個批次的進樣小瓶，考察191003批B-4的溶液穩定性24 h，發現其中一個批次進樣瓶(批號：17306794)pH為8.16呈堿性與文獻報道一致，而且呈堿性的玻璃進樣瓶溶液不穩定(不同批次進樣pH和樣品溶液穩定性如表2所示)。

表2 不同批次進樣pH和樣品溶液穩定性

再取安捷倫進樣瓶(部件號5182-0716)，批號17306794的5個進樣瓶和批號17278167的1個進樣瓶(對照)進行溶液穩定性考察，樣品溶液放置于室溫0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣檢測，發現不同進樣瓶降解速度，不呈規律性，新鮮配制溶液RRT1.13的雜質為0.0%；與日常檢測結果一致(17306794批次進樣瓶降解規律研究如圖3所示)。通過以上調查，說明某些特定批次HPLC玻璃進樣瓶含有堿性物質導致樣品溶液降解生成RRT1.13的雜質。

圖3 17306794批次進樣瓶降解規律

2.3 B-4降解雜質解析

對191003批次B-4的首次檢測樣品溶液進行高分辨質譜分析，判斷RRT1.13的雜質分子量為417與B-4一致。從分子結構分析，B-4結構中兩個羰基之間的氫，因為連接兩個吸電子基團，極性翻轉，容易在堿性條件下離去，形成酮式-烯醇式互變，結構為化合物(5)。烯醇式通常為可逆反應，我們設計了以下實驗組進行確認。

樣品A： 取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL，破壞30 min，用乙腈定容至50 mL(pH=8)。

樣品B：取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%碳酸氫鈉溶液10 mL，破壞30 min，再加入0.1%的磷酸水溶液15 mL中和，用乙腈定容至50 mL(pH=2.5)。

隨州市經濟發展穩速，面對經濟新常態下增速換擋、風險防范等多重壓力，在2017年，全市實現生產總值(GDP)935.72億元，按可比價格計算，同比增長6.8%。其中，第一產業實現增加值150.99億元，增長3.7%;第二產業實現增加值437.3億元，增長6%;第三產業實現增加值347.43億元，增長9.2%。三次產業比重由2016年的16.5∶46.8∶36.7調整為16.1∶46.8∶37.1，服務業占GDP比重比上年提高0.4個百分點。

樣品C：取B-4樣品50 mg，加10 mL乙腈溶解，加入0.1%的磷酸水溶液10 mL，用乙腈定容至50 mL(pH=2.2)。

實驗結果：樣品A中RRT1.13的雜質0.75%，樣品B和樣品C中RRT1.13的雜質為0.0%，而且樣品B和樣品C的雜質譜一致，主峰純度均為99.89%，說明RRT1.13的雜質為B-4的烯醇式化合物(5)。

通過以上異常雜質調查，結果表明RRT1.13的未知雜質為某些含有堿性雜質的玻璃進樣瓶，堿催化生成B-4的烯醇式化合物(5)。

2.4 方法優化

由于玻璃進樣瓶堿性物質，降解雜質沒有規律性，容易產生不必要的OOS結果，所以必須對新采購的進樣瓶進行使用前評估或者更換成酸性稀釋劑中和，顯然采取更換酸性稀釋液，操作更簡單。

將稀釋液由乙腈改為乙腈與0.1%的磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)。配制1 mg ·mL-1的樣品溶液轉移至不同HPLC玻璃進樣小瓶中(批號17306794，已確認有堿性雜質)，置于室溫，進行穩定性考察1、2、3天。

檢測結果RRT1.13的含量均為0.0%，說明更換成酸性稀釋劑，可以避免B-4降解成B-4烯醇式結構。

2.5 最終優化的方法參數

安捷倫色譜儀配VWD檢測器，色譜柱XBP-C18 4.6×150 mm， 5 μm，流動相：60%乙腈水溶液，流速為1.0 mL·min-1，柱溫為30 ℃，VWD檢測器波長為246 nm，樣品濃度為1.0 mg·mL-1，稀釋液：乙腈與0.1%磷酸水溶液的混合液(體積比=60∶40)，進樣量10 μL，運行30 min，面積歸一化法計算。

3 方法學論證

3.1 專屬性實驗

雜質B-3與去氟B-4之間的分離度為13.2，去氟B-4與B-4之間的分離度為3.1(分離度譜圖如圖4所示)，表明專屬性良好。

圖4 分離度譜圖

3.2 重復性實驗

配制6份B-4濃度為1.0 mg·mL-1，B-3濃度為1.2 μg·mL-1，B-4濃度為1.2 μg·mL-1的精密度溶液，連續進樣6針，B-3：RSD%=0.5%，去氟B-4：RSD%=0.0%，B-4：RSD%=0.1%，結果表明本方法精密度良好(精密度結果如表3所示)。

表3 精密度結果 單位：%

3.3 回收率實驗

配制三份供試品溶液，分別加入1.0 μg·mL-1、1.2 μg·mL-1、1.4 μg·mL-1的B-3和去氟B-4，對照溶液為供試品溶液不加雜質，每個回收率溶液進樣3針(回收率實驗結果如表4所示)，結果表明該方法準確度良好。

表4 回收率實驗結果

3.4 線性實驗

配制各個組分線性溶液，濃度詳見下表，依次進樣以峰面積Y為縱坐標，濃度X為橫坐標，進行線性回歸，B-3的線性方程Y=35.902 4X-0.052 0(R2=0.999 7)，B-4去氟的線性方程Y=37.157 5X+0.151 9(R2=0.999 8)，B-4的線性方程Y=31.043 3X- 2 476.177 4(R2=0.999 3)結果表明，各組分線性關系良好。線性測試結果如表5所示。

表5 線性測試結果 單位：μg·mL-1

3.5 定量限、檢測限

用稀釋法稀釋至B-3，B-4，去氟B-4的組分的基線與噪音比約為10時即為LOQ濃度，B-3，B-4，去氟B-4的濃度為0.3 μg·mL-1，相當于B-4的樣品濃度為0.03%；配制6份LOQ的濃度，進樣測試，B-3，B-4，去氟B-4的峰面積RSD%分別為0.6%、0.8%、2.3%，精密度良好。

用稀釋法稀釋至B-3，B-4，去氟B-4的組分的基線與噪音比約為3時即為LOD濃度，B-3，B-4，去氟B-4的濃度為0.1 μg·mL-1，相當于B-4的樣品濃度為0.01%。

即檢測方法的最小檢測量為0.3 μg·mL-1，最低檢測限為0.1 μg·mL-1。

4 討論

(1)本次還進行相關物質B-3和去氟B-4的校正因子研究，B-3和去氟B-4的校正因子均為1.0，說明檢測波長設定為246 nm合理；B-4主峰線性良好，可以采用面積歸一化法計算各個雜質的含量。

(2)本次還對安捷倫，島津，沃特世等主要品牌供應商的HPLC玻璃進樣小瓶，進行研究，研究結果表明，優化后的檢測方法耐用性良好。

5 結語

通過研究表明B-4乙腈溶液在含有堿性物質的HPLC玻璃進樣瓶中，易被堿催化降解，生成烯醇式異構體；通過優化B-4樣品溶液的pH值，可以避免由于進樣瓶原因導致的烯醇式互變；優化后的B-4相關物質的HPLC檢測方法的精密度、準確度、專屬性和線性良好，方法靈敏度高，耐用性良好，可以簡單、快速、準確地用于測定B-4的相關物質。