三參丹飲預處理對心肌缺血再灌注損傷模型大鼠心肌的保護作用初探

韓淑麗，齊玲，姜文月，李鵬東，唐明哲

（清遠市人民醫院，廣東 清遠 511500）

缺血性心臟病是世界范圍內常見的高病死率疾病之一［1－2］。心肌缺血期引起的心肌超微結構、能量代謝及電生理等損傷，在血管再通后反而呈現出加重的趨勢，稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemiareperfusion injury，MIRI）。在MIRI過程中，常伴有代謝紊亂和心肌細胞死亡，心肌的再生能力極為有限，挽救心肌細胞至關重要。而凋亡因其發生具有可逆性，一直是細胞死亡調控研究的熱點。

心肌缺血根據癥狀應歸屬中醫學“胸痹心痛”范疇，《肘后備急方》中記載：“胸痹之病，令人心中堅痞忽痛，肌中苦痹，絞急如刺，不得俯仰，其胸前皮皆痛，不得手犯，胸滿短氣，咳嗽引痛，煩悶自汗出，或徹引背膂。不即治之，數日害人。”從其一系列臨床表現描述上不難看出，我國古代醫家對胸痹早有認識，在治療上也各有側重。《證治準繩·雜病》認為：“氣血不虛則不滯，既虛則鮮有不滯者，所以作痛”。清代王清任所創立的一系列活血化瘀名方，尤其是血府逐瘀湯，在后世也廣泛運用于本病的治療。三參丹飲是國醫大師段富津教授治療胸痹心痛的常用處方，臨床療效顯著［3－4］，但其作用機制還有待進一步研究。以往研究表明，缺血前預處理可以通過多個途徑減輕缺血后再灌注損傷的程度［5－7］。本研究以缺血前預處理作為對照，初步探索三參丹飲對MIRI大鼠心肌的保護作用。

1 材料、試劑與實驗方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar雄性大鼠40只，體質量（200±10）g，由黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心（GLP 實驗室）提供，動物許可證號：SCXK（黑）2013004。于黑龍江中醫藥大學方藥分析實驗室喂養，自由進食攝水，飼養環境室溫（24±2）℃，相對濕度（55±3）%，通風良好。

1.2 主要試劑及藥物

氨基甲酸乙酯（上海山浦化工有限公司，批號：20071010）；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司，批號分別為：20130712、20130625、20130629、20130717）；三參丹飲（黃芪、白參、當歸、川芎、丹參、三七、血竭，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房提供）；生理鹽水（哈爾濱三聯藥業有限公司，批號：100102A10）。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥

所有大鼠隨機分為三參丹組（SSD 組）、模型組（I/R 組）、假手術組（Sham 組）和缺血預處理組（PR組），每組10 只。SSD 組大鼠給予三參丹飲1.44 g/kg灌胃，其余各組大鼠灌胃等體積生理鹽水，在此期間，PR 組在給藥的基礎上，每天進行3 次缺血－恢復灌注的預處理，每次5 min。連續給藥5 d后，除Sham 組外，其余各組大鼠行左前降支結扎－松解術以建立心肌缺血再灌注損傷模型，Sham 組大鼠只開胸，不進行手術操作。

1.3.2 在體大鼠心肌缺血再灌注模型制備

麻醉前準備及麻醉：大鼠在模型制備前12 h 可自由飲水，禁食。灌胃給藥（或給生理鹽水）后1 h 稱重，按1.0 g/kg 體質量計算20%烏拉坦的給藥量，用5 mL注射器抽取烏拉坦并腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后令大鼠平躺，四肢及牙齒均固定在手術臺上。

連接心電機，按照右上肢紅色，左上肢黃色，左下肢綠色，右下肢黑色的連接方式，將電極針插入動物四肢的皮下，連接好導聯線，進行心電圖的記錄。

氣管插管：在頸部中線切約7 mm 小切口，用止血鉗鈍性分離筋膜及頸部肌肉，暴露氣管，過程中避免損傷甲狀腺。用眼科鑷小心剝離氣管，并穿過一雙股手術線備用。在氣管前面做一“V”字形小切口，開啟呼吸機（通氣量7～8 mL/kg，通氣頻率65～70 次/min，吸呼比1∶2，壓力4～5 kPa），迅速沿氣管方向輕輕送入導管，并用雙股手術線將導管與氣管固定。

開胸造模：于胸骨左側捫及心臟搏動處稍偏左剪毛備皮，用75%酒精行術區消毒。用鑷子微微提起皮膚，手術刀行1 cm 縱向切口，再用止血鉗鈍性逐層分離肌層，使肋骨暴露，剪斷第四根肋骨，左手持止血鉗夾住靠胸骨側肋骨斷端稍稍提起，先用眼科鑷輕輕劃開心包膜，再用自制小動物心臟手術器將心臟暴露于手術區，防止肋骨斷端劃傷心臟。心臟暴露后，找到左心耳，確定冠脈左前降支，在左心耳根部下方與肺圓錐之間進針，用6/0 號無創縫合針穿過冠狀動脈左前降支心肌表層約2 mm 穿出后，將50 號魚線用凡士林油紗布反復擦拭，墊于血管之上，打一手術方結，同時結扎魚線與血管，此時結扎線下段的血管已不隨心臟搏動充盈，同時，心臟表面相應區域顏色變暗后，立即將心臟輕柔地送回原位并關閉胸腔，用止血鉗將創口處的皮膚肌肉關閉，在創口表面覆蓋用生理鹽水沾濕的紗布。記錄時間，觀察心電圖出現波形異常高聳表明造模成功，結扎30 min后抽出墊在血管外的魚線，此時可觀察到冠脈左前降支血管逐漸隨心臟搏動而有血流不斷充盈，恢復再灌注120 min。

棄用結扎、再灌注不成功，出血過多及呼吸心跳停止的大鼠。假手術組只穿線，不結扎。每組取8 只觀測指標。

1.4 觀察指標

1.4.1 心電圖檢查

實驗大鼠麻醉后仰臥固定在手術臺上，用針灸針刺于四肢皮下，將各導聯夾連接于針柄上，右上肢連紅色導聯線，左上肢連接黃色導聯線，左下肢連接綠色導聯線，右下肢連接黑色導聯線。打開軟件，記錄心電圖，心電圖出現波形異常高聳表明造模成功。

1.4.2 血清指標檢測

各組大鼠于恢復灌注120 min后，通過眼眶采血法收集血量約2 mL，離心收集上清。嚴格按照試劑盒說明進行LDH、CK、SOD和MDA指標測定。

1.5 統計學分析

應用SPSS 21.0 統計軟件處理分析實驗數據，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間數據比較用單因素方差分析，多重比較采用t檢驗，以P＜0.05代表差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三參丹飲對MIRI大鼠血清LDH、CK水平的影響

與Sham組相比較，I/R組大鼠的LDH和CK水平均明顯升高（P＜0.01），表明I/R 組心肌損傷嚴重，MIRI大鼠模型制備成功；與I/R 組相比較，SSD 組及PR 組的LDH、CK水平明顯降低（P＜0.01）；但SSD組與PR組的LDH、CK 水平接近，差異不具有統計學意義（P＞0.05），表明PR組和SSD組對血清LDH、CK的水平作用相當。結果見表1。

表1 各組大鼠血清LDH、CK水平比較（±s，U/L）

表1 各組大鼠血清LDH、CK水平比較（±s，U/L）

注：與Sham組比較，△△P ＜0.01；與I/R組比較，**P ＜0.01。

組別Sham組I/R組PR組SSD組n8 8 8 8 LDH 435.24±21.68 1 692.53±129.9△△928.34±95.36**919.12±88.97**CK 355.74±42.27 1 356.5±124.45△△834.25±68.26**859.49±84.24**

2.2 三參丹飲對MIRI大鼠MDA、SOD水平的影響

與Sham 組相比較，I/R 組大鼠MDA 水平明顯升高、SOD 水平明顯降低（P＜0.01），表明I/R 組大鼠心肌損傷嚴重；與I/R 組相比較，PR 組、SSD 組大鼠的MDA 水平均明顯降低，SOD 水平均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），表明PR 組及SSD 組大鼠心肌細胞得到了保護；但SSD 組與PR 組SOD、MDA 水平比較，差異不具有統計學意義（P＞0.05），表明兩組對大鼠心肌細胞受到的保護作用相當。結果見表2。

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清SOD、MDA水平比較（±s）

注：與Sham 組比較，△△P ＜0.01；與I/R 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

組別Sham組I/R組PR組SSD組n8 8 8 8 MDA（nmol/mL）1.75±0.16 3.82±0.33△△2.66±0.31**2.71±0.25**SOD（U/mL）146.05±12.83 72.46±6.27△△95.84±10.96**86.26±8.69*

3 討論

缺血性心臟病是世界范圍內導致死亡的主要疾病之一。研究表明，將閉塞的冠狀動脈再恢復灌注可有效降低總病死率，然而恢復缺血心肌血流可導致再灌注損傷，出現心肌細胞功能不全甚至引起心肌細胞死亡［8－10］。既往研究表明，MIRI有調控的可能，主要措施是針對缺血前或再灌注等過程進行各種干預，其中公認的比較有效的實驗策略是缺血預處理及其藥物模擬試驗［11－12］。本實驗采用左前降支墊魚線結扎法進行造模，該結扎方法在恢復灌注時尤其方便。通過監測心電圖發現，冠狀動脈左前降支結扎后心電圖波形異常高聳，急性心肌缺血表現明顯，這表明大鼠急性心肌缺血模型復制成功。而抽出魚線后可看到左前降支血管逐漸隨心臟搏動而有血流充盈，提示手術成功復制了心肌缺血再灌注過程。

國醫大師段富津教授總結各代醫家用藥經驗所創立的三參丹飲，是其在臨床中辨證施治胸痹心痛病時的常用方劑，由白參、三七、川芎、當歸、血竭、丹參、黃芪七味藥物組成。方中白參甘溫，大補元氣，生津安神，為君藥；黃芪味甘，微溫，具有益氣固表的功效，為臣藥，君藥偏于補中益氣，臣藥偏于固護表氣，君臣相伍，可補一身內外之氣；《本草匯言》中有記載：“芎?，上行頭目，下調經水，中開郁結，血中氣藥，嘗為當歸所使，非第活血有功，而治氣亦神驗也”。當歸味甘而重，能補血，其氣輕而辛，故又能行血，補中有動，行中有補；川芎味辛，性溫，辛能發散，具有活血行氣之功，使之補而不滯；丹參善能通行血脈，祛瘀止痛；血竭具有活血止痛，散瘀生新之功效，助三七活血化瘀止痛，且活血而不傷血，均為佐藥。全方各藥相伍，使補氣而不氣滯、活血而不傷血，共奏益氣養血、活血化瘀之效［13］。

目前國內外診斷急性心肌梗死的主要指標包括天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、肌酸激酶同工酶（CKMB）、CK 及LDH［14］。其中CK 屬于靈敏度較高的指標，它存在于心臟、肌肉及腦等組織的胞漿及線粒體中，在分解和合成ATP 的過程中起到關鍵作用。CK 在急性心肌梗死診斷過程中具有較好的臨床價值［15］，可在發病早期的血液中檢測出來。LDH 雖然敏感性不如CK，但其在急性心肌梗死的病程觀察中具有重要的價值，如LDH 在病程中再次升高或恢復緩慢，可預示心肌再梗死、梗死范圍擴大或恢復灌注失敗。本研究選用CK、LDH 作為觀察指標，一方面可以確保心肌缺血檢測的靈敏性，另一方面又能客觀反映恢復灌注的情況。SOD 是生物體內一種重要的氧自由基清除劑，具有重要的生物學功能。心肌缺血再恢復灌注后，會產生大量的氧自由基，氧自由基在SOD 的催化作用下轉變為過氧化氫，過氧化氫在過氧化氫酶和過氧化物酶的作用下會分解為無害的水。所以當體內SOD 缺乏或者SOD 活性下降時，氧自由基將會大量累積，并與生物大分子及心肌細胞膜發生過氧化反應，進而引發氧化應激損傷，導致機體受損，同時產生大量的MDA，因此，MDA 的含量可以作為判斷心肌細胞受損程度的指標。本研究結果顯示，三參丹飲能降低心肌缺血再灌注損傷大鼠血清中CK、LDH 水平，其機制可能是通過上調SOD 活性，降低MDA 水平，提高氧自由基清除率，進而起到保護心肌的作用。

目前，臨床中用藥仍以組方合劑為主，所以目前研究亦局限于復方合劑的整體作用效果，具體起效藥物或具體單體藥效成分，仍有待進一步探索。