益氣養榮復經方對環磷酰胺誘導的卵巢早衰小鼠的治療作用及保護機制

李蘭，鐘達源，楊開鋒，周虹，肖小芹

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40 歲之前發生的卵巢功能衰竭現象，主要表現為促卵泡激素（follicle Stimulating Hormone，FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）降低，雌二醇（estradiol，E2）升高［1-2］，嚴重者可導致閉經甚至不孕。POF的病因復雜，機制尚不清楚。目前研究表明其最常見的原因是自身免疫，其次是遺傳、代謝、理化因素、藥物和感染［3］。而與腫瘤化療藥物相關的POF 也日趨增加［4］。白介素－2（interleukin 2，IL－2）是一種具有廣泛活性的細胞因子，主要由T細胞激活，它可以促進B細胞和NK細胞的增殖，是調節免疫反應的重要因素［5-6］。腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factor－α，TNF－α）是一種重要的炎癥因子，主要由活化的單核巨噬細胞產生，它負責細胞中的各種信號轉導，引起細胞壞死或凋亡，并參與某些免疫調節［7-8］。益氣養榮復經方（YQYR）由黃芪、巴戟天、鐵皮石斛、黃精四種藥物組成，是湖南中醫藥大學第一附屬醫院使用多年的院內成方，對POF患者有很好的療效，但其對POF的潛在保護機制尚不清楚。本實驗采用腹腔注射環磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）建立免疫損傷性POF動物模型，觀察YQYR對模型小鼠的保護作用及對細胞因子IL－2、TNF－α變化的影響，為臨床治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物

健康雌性C57BL/6 小鼠24 只，SPF 級，7～8 周齡，體質量16～19 g，動物許可證號：SCXK（湘）2019－0004。全部小鼠經陰道脫落細胞涂片篩查動情周期正常，飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%，光照12 h 明暗交替，普通飼料飼養，自由攝食飲水。

1.2 藥物與主要試劑

益氣養榮復經方：黃芪、巴戟天、鐵皮石斛、黃精以4∶3∶2∶2 的比例稱取，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。環磷酰胺注射液粉末（國藥準字H20160667，百特醫療貿易有限公司）。小鼠FSH ELISA 試劑盒（批號：20201009EN）、小鼠LH ELISA試劑盒（批號：20201009SP）、小鼠E2ELISA 試劑盒（批號：20201009NJ）、小鼠IL－2 ELISA 試劑盒（批號：20201009TR）、小鼠TNF－α ELISA 試劑盒（批號：20201009KQ），均購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 分組、造模及給藥

將24 只小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組和YQYR 組，每組6 只。小鼠適應性喂養1 周后，除空白組外對其余小鼠進行造模。取CTX 注射液粉末0.2 g，加入生理鹽水10 mL 配制試劑。因CTX 具有自限性，采用首次腹腔注射120 mg/kg，14 d 后每隔3 d 腹腔注射CTX 注射液30 mg/kg，共注射4 次，建立POF 小鼠模型。空白組小鼠腹腔注射與模型組等量的生理鹽水。

造模成功后第2 天開始灌胃給藥。參考《動物藥理學》實驗動物及人體表面積比例，即20 g 的小鼠與70 kg 的人換算關系計算每日灌胃劑量。陽性對照組給予0.3 mL 補佳樂水溶液；YQYR 組給予0.468 mL 中藥藥液（藥物濃度為1.0 g/mL）；空白組和模型組均給予0.3 mL生理鹽水；連續給藥14 d。

1.4 檢測指標

1.4.1 小鼠動情周期、生活行為觀察

適應性飼養1周后，每天早8時采用瑞氏染色法進行小鼠陰道涂片觀察，具體方法參考文獻［9］。觀察腹腔注射CTX后小鼠生活行為變化。

1.4.2 組織病理學檢查

取小鼠卵巢，標本置于4%多聚甲醛溶液固定、脫水、包埋、HE染色，光鏡下觀察卵巢形態。

1.4.3 激素檢測

眼眶取血，離心后取上清液采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清FSH、LH和E2含量。

1.4.4 細胞因子檢測

ELISA法檢測血清免疫因子IL－2、TNF－α變化。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計軟件進行分析。計量資料以均數± 標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠動情周期和生活行為變化比較

空白組小鼠有正常的動情周期（動情前期、動情期、動情間期和動情后期）；與空白組小鼠相比，模型組小鼠動情周期紊亂，無動情期。見圖1。與空白組相比，模型組小鼠活動減少，攀爬減少，反應緩慢，偶有撕咬打架，身體毛發干燥，缺乏光澤，飲水量少于注射前；與模型組相比，YQYR 組和陽性對照組小鼠精神狀態和對刺激的敏感性有所改善。

圖1 小鼠陰道涂片細胞形態（瑞氏染色，×100）

2.2 各組小鼠卵巢組織結構比較

空白組小鼠卵巢組織結構正常，可見各級卵泡形態。見圖2。模型組小鼠卵巢組織未見繼發性卵泡或成熟卵泡，且閉鎖卵泡的數量顯著增加。見圖3。陽性對照組和YQYR 組小鼠的卵巢組織結構明顯改善，各級卵泡明顯存在。見圖4～5。

圖2 空白組小鼠卵巢組織結構

圖3 模型組小鼠卵巢組織結構

圖4 陽性對照組小鼠卵巢組織結構

圖5 YQYR組小鼠卵巢組織結構

2.3 各組小鼠血清FSH、LH含量比較

與空白組相比，模型組小鼠血清FSH、LH 水平升高（P＜0.05），E2含量降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和YQYR 組小鼠的血清FSH、LH 水平均降低（P＜0.05），E2水平均升高（P＜0.05）。見圖6。

圖6 各組小鼠血清中的激素水平比較

2.4 各組小鼠血清IL－2、TNF－α含量比較

與空白組相比，模型組小鼠血清IL－2、TNF－α水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，陽性對照組和YQYR組的IL－2、TNF－α水平均降低（P＜0.05）。見圖7。

圖7 各組小鼠血清中的細胞因子水平比較

3 討論與總結

POF的病因復雜，機制尚不清楚，而作為一種烷基化劑的化療藥物，CTX 已知會嚴重損害處在生殖期的年輕患者的卵巢，導致卵巢包膜增厚、卵巢顆粒細胞凋亡、血管損傷和大量卵泡停滯發育，引起閉經、不育和POF［10-11］。基于此，本研究選擇CTX 作為建立POF 小鼠模型的藥物。

FSH、LH 和E2是用于評價POF 的臨床指標，由于目前尚無診斷POF 的金標準，僅激素指標和臨床癥狀即可用于診斷，因此觀測激素指標和臨床癥狀對于判斷POF 情況尤為重要［12］。在本研究中，空白組小鼠經瑞氏染色顯示小鼠動情周期正常，表現出明顯的動情前期、動情期、動情后期和動情間期。而注射CTX 注射液后，模型組小鼠動情周期紊亂，長期停滯于動情間期，無發情期。且與空白組相比，模型組小鼠還表現出FSH、LH 水平升高和E2水平降低。不僅如此，HE 染色顯示，與空白組相比，模型組小鼠卵巢組織的卵泡發育明顯受到破壞，初級和次級卵泡數目明顯減少，卵泡閉鎖數目明顯增加。卵泡閉鎖可發生在POF 的所有階段，是POF 在組織學上的標志［13］。以上結果共同表明，本實驗中的POF小鼠模型已經成功建立。

經藥物干預后，與模型組相比，YQYR 組和陽性對照組小鼠精神狀態明顯改善；在YQYR 組和陽性對照組小鼠卵巢組織中，均可觀察到初級卵泡、多層初級卵泡和次級卵泡，偶見卵泡閉鎖，說明小鼠卵泡發育已趨正常；激素水平結果表明，陽性對照組和YQYR組小鼠的FSH、LH 水平明顯降低（P＜0.05），E2水平明顯增加（P＜0.05）。以上結果表明YQYR 在生活行為、卵泡發育和激素水平層面對CTX 誘導的POF 小鼠具有保護作用。

目前，化療藥物誘導POF 的相關研究主要集中在細胞因子、外周血T 淋巴細胞亞群及相關抗體上［14-15］。IL－2 和TNF－α 是重要的免疫系統因子，可準確反映人體免疫系統的狀態，在細胞凋亡、增殖和炎癥反應等方面發揮著重要的作用［16-17］。卵巢儲備與卵巢炎癥密切相關，持續的炎癥會加速卵巢衰老［18］。莊粵冰［19］發現自身免疫性POF 患者的IL－2 明顯高于健康患者。IL－2 主要由活化的CD4+T 細胞組成，可促進B 細胞抗體的增殖、分化和分泌，從而誘導濾泡性顆粒細胞凋亡。TNF－α 的功能與細胞凋亡和增殖有關，可通過旁分泌或自分泌誘導細胞增殖和凋亡［20］。研究表明，在某些階段，血清和卵巢組織中TNF－α 表達的下調對受損的卵巢有保護作用，體內TNF－α 水平的升高則會導致卵泡早期凋亡，從而加速卵巢顆粒細胞的凋亡［21］。TNF－α 還會抑制粒細胞的雌激素合成和分泌，破壞卵泡的微環境［22］。在本研究中，模型組小鼠的IL－2、TNF－α 水平顯著升高，而經藥物干預后，YQYR 組和陽性對照組小鼠IL－2、TNF－α 水平顯著降低（P＜0.05），說明YQYR 可通過調控炎性因子改善POF小鼠的卵巢受損情況。

綜上，YQYR 能夠有效調節CTX 誘導的POF 小鼠血清LH、FSH 和E2含量，降低血清中IL－2 和TNF－α的表達水平，改善垂體和卵巢內分泌功能，抑制卵巢顆粒細胞的凋亡，增強卵巢儲備能力，保護卵巢功能。