基于NF－κB信號通路探討針刺緩解干眼豚鼠淚腺炎癥的機制

鄭曉駿，丁寧，徐倩，高衛萍

（南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210029）

干眼是臨床常見的眼表疾病，在該病的發生和演變過程中與炎癥因子之間關系密切，炎癥是干眼的主要發病機制之一［1］。針刺治療干眼，除了能夠有效降低角膜染色評分、增加淚液分泌量、延長淚膜破裂時間之外，也可減輕炎癥反應［2］；相比西藥不僅臨床療效較好，同時毒副作用也較少。為此，積極展開關于針刺治療干眼的抗炎作用機制研究，具有重要的意義。

研究顯示，針刺療法可通過增加α7nAChR，下調NF－κB 信號通路中p65 的表達，從而有效抑制炎癥，減輕各組織損傷［3］。但目前關于針刺可降低干眼動物淚腺組織中炎癥因子表達的研究較少［2］。為此，本研究基于NF－κB 信號通路，以豚鼠進行干眼動物造模，通過檢測干眼豚鼠淚腺組織中相關炎癥因子的表達情況，探討針刺對干眼的抗炎作用和NF－κB 信號通路之間存在的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氫溴酸東莨菪堿注射劑（成都普菲德生物技術有限公司，批號：19011407）；酚紅棉線（遼寧美滋林藥業有限公司）；一次性使用無菌針灸針（φ0.18 × 13 mm，北京中研太和醫療器械有限公司，批號：200628）；熒光素鈉眼科檢驗試紙（天津伊諾新康醫療器械科技有限公司）；蛋白裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）；J3692－A 豚鼠白細胞介素－4（IL－4）、白細胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）ELISA 檢測試劑盒（江蘇晶美生物技術有限公司，批號：2021.03）。

1.2 實驗動物

健康雄性英格蘭短毛三花豚鼠24 只（南京市浦口區萊芙養殖場，SCXK－蘇2019－0005），體質量（300±50）g，常規喂養，飼養環境：溫度24～26 ℃，濕度50%～65%。裂隙燈顯微鏡查眼表無明顯異常。

1.3 動物模型制備與分組

將上述24 只實驗動物，隨機分為空白組、模型組、針刺組及假針刺組，每組各6只（12只眼）。其中，模型組、針刺組、假針刺組每日8：00、11：00、14：00、17：00皮下注射1 次氫溴酸東莨菪堿溶液，每日4 次，劑量為0.6 mg/（0.2 mL·次）［4－5］。第12 天，各組實驗動物的Prtt 檢測結果同實驗前及空白組相比，具有統計學意義（P＜0.05），表明干眼動物模型建立。實驗遵循《國家實驗動物管理保護條例》，并通過南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會批準（批準號：2021DW0201）。

1.4 實驗方法

空白組常規飼養，不做任何造模處理及治療。模型組、針刺組及假針刺組每日4次皮下注射東莨菪堿，直至實驗結束，共26 d。其中，在第12 天造模成功后，模型組不做任何處理。針刺組每日給予針刺治療，穴位取雙側睛明、攢竹、絲竹空、太陽、瞳子髎。穴位定位參照《實驗針灸學》［6］。睛明針尖向內下方斜刺入皮下，攢竹向下平刺，太陽直刺，瞳子髎直刺，均不行針，留針15 min。絲竹空透太陽，每日1次，連續治療14 d。假針刺組則以鈍針頭每天淺刺激本組實驗動物眼周穴位，取穴方法及治療天數均同針刺組。

1.5 干眼相關指標檢測方法

分別于實驗第0 天（實驗前）、實驗第12 天（造模后）、實驗第26天（治療后）對各組實驗動物的BUT、FL及Prtt進行檢測。具體方法如下：

1.5.1 BUT檢測

將濕潤的熒光素鈉染色試紙輕點于實驗動物下穹隆部，輔助動物眨眼后，使用裂隙燈觀察，記錄首個角膜干燥斑出現所用的時間，每只眼均檢測3次，取平均值。

1.5.2 FL檢測

將濕潤的熒光素鈉染色試紙輕點于實驗動物下眼瞼穹窿部，輔助動物眨眼后進行計分。計分標準：采取角膜病變劃分法，使用裂隙燈觀察，以角膜中心為垂直和水平兩條線的交點，將角膜劃分為四等份，每等份分別計0～3 分，不染色時計0 分，5 個以下點染計1 分，5 個以上的點染計2 分，塊狀染色計3 分，最后將各等份內的分數進行相加，滿分為12分。

1.5.3 Prtt檢測

把酚紅棉線一端少許輕折，用眼科鑷小心輕夾反折處后，小心放入動物結膜囊內，輔助動物閉眼，并計時20 s，再取出棉線，測量其被浸潤的實際長度。

1.6 免疫組織化學染色檢測

實驗第26 天處死所有豚鼠，立即從各組實驗動物中，隨機取3 只左眼部分淚腺組織，通過多聚甲醛固定和常規石蠟包埋。用PBS 液沖洗3 次后，以正常山羊血清封閉，室溫孵育10 min。傾去血清，勿洗，滴加p65（1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗5 min×3 次，滴加新鮮配制的DAB 顯色劑。自來水充分沖洗，蘇木精復染，自來水沖洗返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。

1.7 Western Blot檢測

實驗第26 天，處死各組實驗動物后，取下各組實驗動物的右側淚腺，剪碎加入裂解混合液于冰上裂解30 min，待裂解完畢后離心5 min 取上清液，用BCA 法提取蛋白、濃度測定。樣品經上樣緩沖液稀釋后于12% SDS－PAGE 分離膠電泳，轉膜后用5%脫脂奶室溫封閉2 h。洗膜后，加入α7nAChR（1∶1 000），p65（1∶2 000）抗體4 ℃孵育過夜，二抗室溫下孵育2 h，洗膜10 min×3 次后曝光。以GAPDH 作為內參，對條帶進行光密度分析。

1.8 ELISA檢測

用上述提取的蛋白按照IL－4、IL－10、TNF－α ELISA試劑盒說明書檢測各組淚腺組織中因子的含量。

1.9 統計學方法

采用SPSS26軟件進行統計學分析，數據用±s進行表示，采用單因素方差分析法，隨后進一步采用LSD進行多組兩兩對比。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組不同時段BUT比較

實驗前各組BUT 比較差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，除空白組外，其余各組的BUT同實驗前相比均有所下降，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；治療后，模型組和空白組相比明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；針刺組同模型組相比明顯上升，差異具有統計學意義（P＜0.05）；假針刺組同針刺組相比明顯下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組不同時間段BUT比較（±s，s）

表1 各組不同時間段BUT比較（±s，s）

注：與空白組比較，＊P ＜0.05；與模型組比較，#P ＜0.05；與針刺組比較，▲P ＜0.05；與實驗前比較，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；與造模后比較，￥P ＜0.05。

實驗前空白組模型組針刺組假針刺組n 6 6 6 6實驗前7.17±2.69 8.50±3.26 9.83±4.26 8.93±3.96造模后7.25±2.80 5.33±3.31Δ 6.17±3.79Δ 4.75±2.83ΔΔ治療后8.00±3.28 2.58±1.51＊￥6.50±3.09#3.33±2.02▲

2.2 各組不同時段FL比較

實驗前各組FL 比較差異無統計學意義（P＞0.05）。造模后，各組實驗動物的角膜染色評分和實驗前相比均呈現上升趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.01）；并且模型組、針刺組、假針刺組同空白組相比明顯上升，差異也均具有統計學意義（P＜0.01）；治療后，空白組和造模后相比有所下降（P＜0.05），但與實驗前相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；模型組同空白組對比上升顯著（P＜0.01）；針刺組同模型組相比顯著下降（P＜0.01）；假針刺組同針刺組相比，高于針刺組（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組不同時間段FL比較（±s，分）

表2 各組不同時間段FL比較（±s，分）

注：與空白組比較，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.05；與針刺組比較，▲▲P ＜0.01；與實驗前比較，△△P ＜0.01；與造模后比較，￥P ＜0.05，￥￥P ＜0.01。

組別空白組模型組針刺組假針刺組n6 6 6 6實驗前1.17±0.94 1.00±0.85 1.17±1.45 1.42±1.56造模后3.43±2.94ΔΔ 7.17±3.79ΔΔ＊＊7.08±2.58ΔΔ＊＊7.00±3.13ΔΔ＊＊治療后1.75±1.29￥8.33±1.86＊＊3.42±1.83￥￥##6.75±3.23＊＊▲▲

2.3 各組不同時段Prtt比較

實驗前各組之間的Prtt 比較差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后，除空白組之外，其余各組的Prtt同實驗前對比均顯著下降（P＜0.01）；并且，同空白組對比，模型組、針刺組、假針刺組均顯著下降，差異亦存在統計學意義（P＜0.01）；治療后，模型組和空白組對比顯著下降（P＜0.01）；針刺組同模型組相比上升明顯（P＜0.01）；假針刺組和針刺組相比顯著下降（P＜0.01）。結果見表3。

表3 各組不同時間段Prtt比較（±s，mm/20 s）

表3 各組不同時間段Prtt比較（±s，mm/20 s）

注：與空白組比較，＊＊P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01；與針刺組比較，▲▲P ＜0.01；與實驗前比較，△△P ＜0.01；與造模后比較，￥￥P ＜0.05。

組別空白組模型組針刺組假針刺組n6 6 6 6實驗前10.21±5.00 9.63±2.37 10.21±2.35 9.33±3.31造模后9.96±5.67 4.17±1.27ΔΔ＊＊5.38±1.60ΔΔ＊＊4.96±3.00ΔΔ＊＊治療后10.21±5.00 2.83±3.43＊＊9.50±3.78ΔΔ##1.42±2.39ΔΔ＊＊▲▲

2.4 各組淚腺中NF－κBp65 蛋白的免疫組織化學染色檢測結果

與空白組對比，模型組淚腺組織中NF－κBp65 相對表達量顯著升高（P＜0.01）；與模型組對比，針刺組淚腺組織中NF－κBp65 蛋白的相對表達量顯著下降（P＜0.01）；與針刺組對比，假針刺組淚腺組織中NFκBp65 的相對表達量則明顯升高（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組豚鼠淚腺中NF－κBp65蛋白的相對表達量（×200）

2.5 各組淚腺中α7nAChR 及NF－κBp65 的Western Blot檢測結果

與空白組對比，模型組淚腺組織中α7nAChR 的相對表達量明顯降低（P＜0. 01），NF－κBp65 則顯著升高（P＜0. 01）；與模型組對比，針刺組中的α7nAChR 的 相對表達 量顯著升 高（P＜0. 01），NF－κBp65 則顯著下降（P＜0. 01）；與針刺組對比，假針刺組淚腺組織中α7nAChR 的相對表達量有所下降，而NF－κBp65 則顯著升高（P＜0. 01）。結果見圖2 和圖3。

圖2 各組豚鼠淚腺中α7nAChR的表達水平

圖3 各組豚鼠淚腺組織中NF－κBp65蛋白的表達水平

2.6 各組淚腺中IL－4、TNF－α和IL－10的含量比較

與空白組對比，模型組淚腺組織中IL－4 的含量高于空白組（P＜0.01）；與模型組對比，針刺組實驗動物淚腺組織中IL－4 的含量顯著下降（P＜0.01）；與針刺組對比，假針刺組實驗動物淚腺組織中IL－4 的含量升高（P＜0.01）。結果見圖4。

圖4 各組豚鼠淚腺中IL－4的含量對比情況

與空白組對比，模型組實驗動物淚腺組織中TNFα的含量高于空白組（P＜0.01）；與模型組對比，針刺組實驗動物淚腺組織中TNF－α 的含量明顯下降（P＜0.05）；與針刺組對比，假針刺組實驗動物淚腺組織中TNF－α的含量升高（P＜0.01）。結果見圖5。

圖5 各組豚鼠淚腺中TNF－α的含量對比情況

與空白組對比，模型組實驗動物淚腺組織中IL－10的含量高于空白組（P＜0.05）；與模型組對比，針刺組實驗動物淚腺組織中IL－10 的含量明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與針刺組對比，假針刺組實驗動物淚腺組織中IL－10 的含量明顯上升（P＜0.05）。結果見圖6。

圖6 各組豚鼠淚腺中IL－10的含量對比情況

3 討論

在參與炎癥反應的過程中，NF－κBp65 被激活后與目的基因相結合，從而促進IL－4、TNF－α 和IL－10等炎癥因子的大量釋放［1］。而其上游的α7nAChR 在機體抗炎過程中，具有重要作用［3］，具體為通過增加α7nAChR，可有效抑制NF－κBp65 的激活，減少IL－4、TNF－α 和IL－10 等炎癥因子的釋放，從而有效抑制炎癥反應，減輕機體組織損傷［1］。

本研究以皮下注射東莨菪堿誘導干眼豚鼠模型，造模后的結果顯示，實驗動物的角膜染色評分顯著上升，淚膜破裂時間、淚液分泌量明顯減少，表示造模成功。模型組淚腺組織中IL－4、TNF－α 和IL－10 含量明顯上升，NF－κBp65蛋白相對表達量顯著升高，表明在NF－κB 信號傳導通路被激活后，釋放炎癥因子，損傷淚腺細胞，促使淚腺腺泡細胞凋亡，導致淚液分泌減少，淚膜穩定性下降，角膜熒光染色上升，從而誘發干眼［7］。經針刺干預后，針刺組干眼豚鼠角膜染色評分下降、淚膜破裂時間延長、淚液分泌量增多，淚腺組織中IL－4、TNF－α 和IL－10 含量明顯下降，NFκBp65 蛋白相對表達量明顯減少，α7nAChR 相對表達量明顯增多，表明通過針刺治療之后，可能存在增加淚腺組織中α7nAChR，下調NF－κBp65 表達，從而抑制IL－4、TNF－α 和IL－10 等炎癥因子的釋放，緩解干眼癥狀。

中醫學認為，干眼屬“白澀癥”“神水將枯”等范疇，基本病理改變以“陰虛內熱”為本［8-15］。通過針刺眼周穴位治療，可起到滋陰清熱，并促進眼周經絡氣血循環，從而有效改善干眼不適癥狀［16-18］。在眼周穴位中，太陽為經外奇穴，主治目疾。《圣惠方》云太陽“理風，赤眼頭痛，目眩澀”；晴明既是足太陽經穴，又是五脈之會，乃治眼病要穴，可宣泄郁熱，主治目疾；瞳子髎為足少陽膽經頭面部的第一穴，有祛風，泄熱，明目之功效；攢竹為膀胱經之穴，取之以資調眼部氣血，滋陰清熱，《銅人》云攢竹“治眼中赤痛及瞼膶動”；絲竹空為手少陽之穴，主目赤腫痛。因此，將以上各穴聯用，可共奏滋陰清熱的功效。本研究發現，針刺眼周穴位，能夠起到較好的滋陰清熱及促進眼周氣血循環，從而有效改善干眼癥狀。

綜上，本研究基于NF－κB 信號通路，初步探討了關于針刺對干眼動物淚腺組織中炎癥因子的調控機制。但本研究同樣存在其局限性和不足，如樣本量較小等，而這些也有待日后進一步完善和改進。