紫癜性腎炎患兒血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡的關系研究

謝宇飛，馬彩霞，楊麗萍

復旦大學附屬中山醫院青浦分院兒科，上海 201700

紫癜性腎炎(Henoch schonlein purpura nephritis，HSPN)屬于過敏性紫癜(Henoch schonlein purpura，HSP)患者較為嚴重的一種并發癥，亦是臨床發病率較高的一種繼發性腎臟疾病[1]。若不及時給予治療，則可能導致患者的腎臟產生明顯的損傷，進而危及身體健康[2]，因此，早期準確診斷HSPN顯得尤為重要，亦是提高臨床治療效果以及改善預后轉歸的關鍵。有研究報道表明[3]，B淋巴細胞活化因子(B lymphocyte activating factor，BAFF)介導多種自身免疫類病癥的發生、發展過程，但關于其是否介導了HSPN的發生、發展以及免疫功能調節過程的研究并不多見。中期因子(Midkine，MK)主要表達于血管內皮細胞，亦可表達于部分器官黏膜上皮細胞中，在正常生理狀態下微量表達，而在病理條件下可能出現高表達，可能具有促進炎癥因子釋放、刺激血管生產以及促進腫瘤進展等作用[4]。Th17細胞是近年來免疫學研究的熱點，其和調節性T細胞之間的平衡被打破是目前臨床上公認的自身免疫性疾病發生的關鍵[5]。鑒于此，本文通過研究HSPN患兒血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡的關系，旨在為臨床HSPN的診治提供新的靶點與思路，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 將復旦大學附屬中山醫院青浦分院兒科2017年1月至2020年1月收治的71例HSPN患兒作為研究組。其中男性37例，女性34例；年齡4～11歲，平均(7.42±1.34)歲。另取同期我院收治的70例HSP患兒作為HSP組，其中男性38例，女性32例；年齡4～12歲，平均(7.51±1.31)歲。納入標準：(1)HSP患兒均符合《兒童過敏性紫癜循證診治建議》[6]中的有關診斷標準；(2)HSPN患兒均符合《紫癜性腎炎診治循證指南》[7]中的有關診斷標準；(3)納入研究前尚未接受相關治療；(4)患兒家長或其監護人知情同意。排除標準：(1)其他原發或是繼發型腎臟類疾病者；(2)合并感染性疾病，免疫功能異常者；(3)研究前1個月已實施免疫抑制劑或是糖皮質激素類藥物治療者。另選取同期于我院體檢的70例健康志愿兒童作為對照組。其中男性35例，女性35例；年齡4～11歲，平均(7.47±1.35)歲。三組受檢者的性別和年齡比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經我院倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 (1)血清BAFF、MK水平：分別于清晨空腹狀態下采集所有受試者的靜脈血6 mL，2 330 r/min離心10 min處理，獲取血清分成兩份置于冰箱中保存備用，其中一份采用酶聯免疫吸附法檢測血清BAFF、MK水平，操作嚴格按照試劑盒(分別購自美國R&D公司以及eBioscience公司)說明書完成。(2)腎損傷指標：采用7060型全自動生化分析儀檢測腎損傷指標，包括尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白、尿β微球蛋白、尿素氮以及肌酐，具體操作遵循儀器說明書進行。(3)Th17細胞比例：首先采集血液樣本，以肝素鋰進行抗凝，同時予以RPM1 1640稀釋，加入20μL的離子霉素、25μL的PMA、4μL的佛波酯，置于37℃條件下進行時長為240～360 min的孵育。隨后將其均勻分作兩管，一管加入CD3-PerCP，另一管加入CD8-FITC，室溫條件下予以15 min的孵育，加入100μL的固定液，室溫下避光靜置15 min。隨后分別于兩管中加入IgG1-PE以及IL-17-PE，室溫條件下靜置15 min。采用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer，PBS)洗滌、重懸后以流式細胞儀完成檢測。(4)調節性T細胞比例：通過Ficoll分離液采集外周血PBMCs，調節細胞數至1×106/mL，加入10μL的CD4-FTTC以及CD25-APC抗體，放置在4℃條件下進行時長為20min的孵育，采用PBS洗滌，并加入400μL的固定/穿膜液，放置在室溫條件下靜置40 min。再經PBS洗滌，加入800μL的緩沖液，放置在室溫條件下靜置20 min。重懸處理后均勻分作兩管，一管加入F0XO3-PE抗體，另一管加入對照抗體，放置在室溫條件下孵育30 min，經PBS洗滌及重懸之后通過流式細胞儀完成測定。(5)Th17細胞相關因子水平：另一份血清樣本采用酶聯免疫吸附法檢測白細胞介素-6(Interleukin-6，IL-6)以及白細胞介素-17(Interleukin-17，IL-17)水平，上述操作遵循試劑盒(購自深圳晶美生物科技有限公司)說明書完成。

1.3 觀察指標 比較三組受試者的血清BAFF、MK水平，腎損傷相關指標，Th17和調節性T細胞比例以及Th17細胞相關因子水平，分析血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡的相關性。

1.4 統計學方法 應用SPSS22.0軟件進行數據統計分析，計量資料呈正態分布，均數±標準差(±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，計數資料比較采用χ2檢驗。血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡的關系采用Pearson相關性分析。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的血清BAFF、MK水平比較 研究組患兒的血清BAFF水平明顯低于HSP組和對照組，而血清MK水平明顯高于HSP組和對照組，其中HSP組患兒的血清MK水平明顯高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，但HSP組患兒的血清BAFF水平與對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的血清BAFF、MK水平比較(±s)

表1 三組受檢者的血清BAFF、MK水平比較(±s)

注：與對照組比較，a P<0.05；與HSP組比較，b P<0.05。

組別研究組HSP組對照組F值P值例數71 70 70 BAFF(μg/L)0.65±0.20ab 1.27±0.44 1.28±0.45 16.203 0.001 MK(pg/mL)314.22±80.14ab 176.12±48.91a 101.32±40.36 20.585 0.001

2.2 三組受檢者的腎損傷指標水平比較 研究組患兒的尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白及尿β微球蛋白水平明顯高于HSP組和對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，而HSP組患兒的尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白及尿β微球蛋白水平分別與對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)。三組受檢者的尿素氮及肌酐水平比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的腎損傷指標水平比較(±s)

表2 三組受檢者的腎損傷指標水平比較(±s)

注：與對照組比較，a P<0.05；與HSP組比較，b P<0.05。

組別研究組HSP組對照組F值P值例數71 70 70尿微量白蛋白(mg/dL)17.37±3.25ab 0.78±0.21 0.72±0.25 22.195 0.001尿轉鐵蛋白(mg/dL)1.27±0.34ab 0.18±0.05 0.17±0.02 22.451 0.001尿β微球蛋白(mg/L)0.45±0.08ab 0.22±0.03 0.21±0.04 21.344 0.001尿素氮(μmol/L)3.71±0.68 3.72±0.69 3.66±0.52 1.305 0.734肌酐(mmol/L)30.42±7.33 29.45±7.05 28.47±7.11 1.592 0.721

2.3 三組受檢者的Th17和調節性T細胞比例及血清IL-6、IL-17水平比較 研究組患兒的Th17細胞比例及血清IL-6、IL-17水平明顯高于HSP組，而調節性T細胞比例明顯低于HSP組，且HSP組Th17細胞比例及血清IL-6、IL-17水平明顯高于對照組，而調節性T細胞比例明顯低于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 三組受檢者Th17和調節性T細胞比例及血清IL-6、IL-17水平比較(±s)

表3 三組受檢者Th17和調節性T細胞比例及血清IL-6、IL-17水平比較(±s)

注：與對照組比較，a P<0.05；與HSP組比較，b P<0.05。

組別研究組HSP組對照組F值P值例數71 70 70 Th17細胞比例(%)1.56±0.35ab 0.68±0.14a 0.52±0.11 25.233 0.001調節性T細胞比例(%)2.51±0.52ab 6.31±1.37a 7.91±1.44 17.195 0.001 IL-6(pg/mL)21.45±5.11ab 14.72±3.10a 10.44±2.09 12.290 0.001 IL-17(ng/L)91.56±20.15ab 45.10±14.56a 20.62±3.92 14.106 0.001

2.4 血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡的相關性 經Pearson相關性分析顯示：血清BAFF與Th17細胞比例、尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白、尿β微球蛋白及血清IL-6、IL-17均呈負相關(P<0.05)，與調節性T細胞比例呈正相關(P<0.05)；血清MK與Th17細胞比例、尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白、尿β微球蛋白及血清IL-6、IL-17均呈正相關(P<0.05)，與調節性T細胞比例呈負相關(P<0.05)，見表4。

表4 血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡的相關性

3 討論

HSP作為一種全身性小血管炎，關于其發病機制迄今尚未完全闡明[8-9]。相關研究報道指出，HSP作為變態反應性疾病之一，全身發生持續的微炎癥狀況是導致癥狀反復及腎臟受損的關鍵性原因，而患兒的長期預后受腎臟受累的直接影響[10-11]。HSPN作為HSP的一種嚴重并發癥，其具體發病機制仍存在一定的爭議，目前普遍認為可能和體液免疫以及細胞免疫功能紊亂等密切相關[12]。

BAFF在B淋巴細胞成活以及成熟過程中個發揮著至關重要的作用，主要表達于髓系細胞，在機體自身的免疫類疾病中的有關作用已廣受關注，已有研究報道證實多種腎臟疾病患者的血清BAFF水平存在顯著改變，可能參與疾病的形成及發展進程[13-14]。此外，MK介導了多類疾病的形成，可通過調控Th1細胞分化以及Treg細胞分化等途徑發揮促炎作用，于急慢性腎臟疾病中的表達明顯升高，值得臨床重點關注[15]。此外，相關研究報道證實[16]，HSP患兒存在不同程度的Th17和調節性T細胞失衡，即Th17細胞水平升高，調節性T細胞水平下降，且兩者比例失衡程度和疾病以及腎臟損害程度高度相關。由此推測，上述相關指標可能在HSP以及HSPH的發生、發展過程中起著至關重要的作用，通過探討其臨床意義，可為疾病的診治提供參考依據。

本研究發現，HSPN患兒血清BAFF存在異常低表達，而MK存在異常高表達。考慮原因可能是BAFF主要功能在于調節B淋巴細胞的大小以及功能，刺激B淋巴細胞存活、增殖抗原呈遞等，間接參與了機體免疫反應。其中HSPN患者體內的BAFF受體存在明顯的表達增加，在和其受體特異性結合后，會引起血循環中的游離BAFF水平下降。MK既具有促血管形成以及加速內皮細胞增殖的重要作用，同時可發揮一定的刺激IL-17以及IFN-γ合成、分泌的作用，繼而起到促炎的目的，因此其水平的升高往往預示機體炎癥反應的加劇，故此，在HSPN患兒血清中存在明顯高表達[17]。

有研究表明，尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白以及尿β微球蛋白等指標能夠有效地反映出人體腎功能的有關狀態，已被廣泛地應用于臨床監測過程中[18]。本研究顯示，研究組尿微量白蛋白、尿轉鐵蛋白以及尿β微球蛋白水平均高于HSP組及對照組，而HSP組與對照組上述指標比較無明顯差異，這提示了研究組患兒的腎功能存在較為明顯地損害，原因主要考慮與HSPN患兒的腎炎病情處于較為強烈的進展狀態等因素有關，而這將從腎功能相關監測指標中得到明顯地反饋，因此上述三項指標的含量水平明顯升高。

此外，HSPN患兒存在明顯Th17和調節性T細胞失衡。過度活化的Th17細胞可通過大量合成、分泌IL-17以及IL-6等多種促炎細胞因子，誘導巨噬細胞、上皮細胞以及內皮細胞形成多類細胞因子以及趨化因子，從而致使炎癥反應被放大，引起血管的炎癥性損傷，介導了HSPN的發生、發展過程。調節性T細胞存在明顯的免疫抑制效果，其可經由多個差異性的環節有效抑制各類效應T細胞的自主活化、增殖以及效應，繼而維持自身免疫耐受，但其水平降低時可能提升B細胞數量和活力，進一步促進免疫球蛋白的分泌，從而誘導大量的免疫復合物在腎小球的有關毛細血管壁亦或是基底膜中發生沉積，最終引起腎臟免疫損傷[5]。進一步研究表明，血清BAFF、MK水平與腎損傷及Th17和調節性T細胞平衡存在密切相關。究其原因可能是隨著血清BAFF水平的降低以及MK水平的升高，使患兒病情不斷加重，腎臟損傷程度無疑隨之增加，最終引起各項腎功能指標水平發生對應改變。同時，BAFF、MK可能經由抑制機體內調節性T細胞的有關途徑，提升了Th17和調節型T細胞二者失衡的風險，間接介導HSPN的發生。

綜上所述，HSPN患兒血清BAFF過低表達，而MK過高表達，兩者可能是通過調控Th17和調節性T細胞平衡狀態間接參與HSPN的發生。