數字PCR技術在動物疫病檢測中的應用

陳林軍，崔 強，于志超，李軍燕，羅曉平，王海艷，延 涵，劉 丹，趙治國

（1.呼和浩特海關技術中心，內蒙古 呼和浩特 010020；2.廣東海洋大學濱海農業學院，廣東 湛江 524088；3.內蒙古自治區農牧業科學院獸醫研究所，內蒙古 呼和浩特 010031）

近幾十年來，基于分子生物學技術，已經建立了許多核酸檢測方法應用于動物疫病的實驗室檢測。這些方法優點較多，通常其敏感性及特異性高，并且提供了更簡單的標準化檢測程序。實驗室核酸檢測方法，包括普通PCR、巢式PCR（nested PCR）、限制性片段長度多態性PCR（PCR-restrictionfragment length polymorphism，PCR-RFLP）、隨機擴增多態性DNA（random amplifed polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）、實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、環介導等溫擴增 （loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、多重連接依賴性探針擴增（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）、高分辨率熔解曲線（high resolution melting，HRM）以及DNA測序［1-4］。上述方法有些已成功用于動物疫病實驗室的檢測，但是有的靈敏度仍然受到自身技術限制，尤其是在低豐度樣本及復雜性樣品檢測中。近些年，數字PCR（digital PCR，dPCR）已被用于核酸檢測，例如轉基因成分分析、動植物產品檢測等［5-6］，特別是在腫瘤學診斷中其顯示出了巨大潛力［7-8］。盡管dPCR在動物疫病實驗室檢測領域的應用相對不及醫學領域的快速發展，但該方法可能在將來診斷和控制動物疫病中發揮重要作用，未來將需要更精確靈敏的診斷手段來支持流行地區的動物疫病控制，以及在動物疫病非流行地區所進行的流行病學監測。

1 原理

dPCR能夠對樣品中存在的目標核酸進行絕對定量，避免了qPCR的不足［9］。dPCR，首先通過預處理，將樣品稀釋和分配到多個獨立分區中，通過創建“油包水”乳液（微滴式數字PCR）、使用具有微通道的芯片（微流控芯片數字PCR）或微流體芯片（微滴芯片式數字PCR）實現分區，每個分區包含很少或者沒有目標序列；然后，每個分區充當單獨的PCR微反應器，PCR擴增后，每個分區被量化為具有或不具有靶序列，即為陽性（1）或陰性（0）結果；最后熒光檢測包含擴增靶序列的分區，根據泊松分布原理以及陽性分區與總數的比值確定樣品中待檢靶分子的濃度或拷貝數［10-12］。因為樣品分配可有效地將目標序列集中在分隔的微反應器中減少了模板競爭，能夠檢測稀有突變以及痕量核酸；此外，它還允許PCR擴增反應對樣品中存在的抑制劑具有更高的耐受性［13］。根據反應單元形成方式的不同，數字PCR主要可分為微滴式數字PCR、微流控芯片數字PCR和微滴芯片式數字PCR等。

1.1 微滴式數字PCR

微滴式數字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）基于乳液PCR（emulsion PCR）技術［14］，通過油水不相容的原理，油形成油膜將水包裹在其中，形成一個個微滴作為反應室。微滴發生器可將樣品生成數萬乃至百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴，每個微滴都成為一個獨立的反應器，隨后微滴完成PCR擴增，最后微滴分析儀對微滴逐個進行熒光檢測。相比陰性微滴，包含至少一個目標核酸分子的陽性微滴的熒光信號強度增加，最后根據泊松分布，通過陽性微滴的比例給出目標分子的絕對拷貝數［15-16］。微滴式數字PCR過程通常包括微滴生成、微滴反應以及微滴檢測3個過程，但也有將3個過程高度集成的設備，如Bio-Rad QX ONE數字PCR系統整合了微滴生成、熱循環反應及微滴讀取等步驟，最大程度減少人工操作，還配備4個獨立的熒光檢測通道提高了實驗通量。

1.2 微流控芯片數字PCR

微流控芯片數字PCR基于微流控芯片技術，芯片由微米級流體的管道、反應器等元件構成，其結構極大地增加了流體環境的面積/體積比，可以最大限度利用液體與物體表面有關的特殊性能［17］。如由層流效應引發的微管道中液體的層流狀態使得在非平衡狀態下對微流體的操控成為可能，毛細效應、快速熱傳導和擴散效應使得微流控器件對樣品流體具有高效的處理能力，從而芯片可快速并準確地將樣品流體分成若干個獨立的分區［18］。PCR反應之后，再讀取每個獨立分區得到熒光信號并計數。微流控芯片的優勢是在一張芯片上就可以完成樣品加樣、預處理、PCR、檢測等系列過程。目前使用微流控芯片技術的數字PCR系統主要有Fluidigm公司的Biomark HD基因分析系統、Thermo Fisher Scientific公司的QuantStudio 3D數字PCR系統［19］。微流控芯片數字PCR在醫學臨床主要應用領域是進行多基因位點平行檢測以指導臨床用藥。

1.3 微滴芯片式數字PCR

以主流的法國Stilla Technologies公司開發的Naica Crystal全自動微滴芯片數字PCR為例，由微滴生成/擴增儀和微滴閱讀分析系統組成，全程僅需唯一耗材，即Sapphire芯片（cutting-edge微流體芯片），可封閉式完成從加樣、微滴生成和擴增，到采集數據獲得結果的全程。先將PCRmix加入芯片，再置于微滴生成擴增系統反應，即可自動獲得25 000～30 000個均勻一致的微滴，且以單層平鋪方式形成2D陣列；進入PCR擴增步驟，無需將生成微滴轉移至PCR管中；隨后使用微滴閱讀分析系統和專用軟件對微滴成像，用以檢測包含擴增片段的微滴，通過對陽性微滴計數從而得到核酸絕對數量［20］?；贜aica數字PCR平臺開發的針對新型冠狀病毒（2019-nCoV）的高度特異、高靈敏的數字PCR絕對定量檢測方法，可降低由假陰性帶來的病原擴散潛在風險。

2 應用

在進行核酸絕對定量時，數字PCR技術因極高的靈敏度，充分彌補了依靠Ct值（qPCR技術）不能達到較好分辨效果的不足。在動物疫病檢測中，可以用與qPCR相同的反應混合物和循環條件設計dPCR方案，使結果更準確，從而可以進行更精確的診斷。

2.1 dPCR在細菌性動物疫病檢測的應用

梅力等［21］建立的布魯菌微滴數字PCR檢測方法，最低檢測下限可達1.12拷貝/μL，可對布魯菌感染的臨床樣品進行定量檢測。田國忠等［22］建立了布魯菌微滴數字PCR方法，布魯菌核酸DNA為3.68 fg/反應時，ddPCR檢出靶標基因拷貝數可達1拷貝/反應，可檢測微量核酸DNA。Song等［23］利用ddPCR檢測結核分支桿菌特異性基因（M.tb-specific CFP10），對于ddPCR，CFP10的檢測限為1.2拷貝/μL，而qPCR為15.8拷貝/μL。王建峰等［24］針對幼蟲芽孢桿菌16SrRNA基因建立幼蟲芽孢桿菌微滴式數字PCR檢測方法，檢測靈敏度可達2.9拷貝/μL。

2.2 dPCR在病毒性動物疫病檢測的應用

Zhao等［25］利用ddPCR檢測法分別對副痘病毒屬（PAPV）目前已知所有病毒［羊口瘡病毒（ORFV）、偽牛痘病毒（PCPV）和牛丘疹性口炎病毒（BPSV）］等進行了檢測。Benjamin等［26］首次應用ddPCR技術在高通量樣品條件下對二代測序技術進行驗證。Boettger等［27］首次證明了ddPCR試驗結論與NGS結論高度吻合。鄔旭龍等［28］建立的非洲豬瘟病毒ddPCR方法，dd PCR的最低檢測限度可達到0.36拷貝，靈敏度是qPCR的10倍。蘭德松等［29］研究建立的dd PCR方法對PRV gD、gE基因的敏感性比相應的qPCR方法高10倍。董桂偉［30］建立了禽腺病毒檢測方法，qPCR檢出質粒標準品的最低濃度為100拷貝/μL，而dd PCR方法為10拷貝/μL。

2.3 dPCR在寄生蟲病檢測的應用

目前對于低豐度目標序列的檢測，定量PCR、雜交等方法都因受到背景DNA的干擾，使得檢測靈敏度及精確性都達不到精確定量的要求。與相同生物材料上進行的qPCR相比，dPCR顯示出高靈敏度的檢測，尤其是在含有PCR擴增抑制劑的樣品中，如對糞便中隱孢子蟲的定量分析［31］。dPCR在要求高精度進行定量檢測的診斷中是一種較有效的方法，例如臨床樣品中的寄生蟲負荷，以及患者之間或在不同時間點采集的樣品中寄生蟲的統計比較。在血吸蟲病檢測中，某種程度上dPCR結果能夠更早和特異性檢測到日本血吸蟲［32］。據報道，dPCR檢測法是檢測和定量核酸小片段（例如cfDNA和micro-RNA）的新方法，是一個有希望的潛在診斷應用，尤其是在針對血吸蟲病消除的國家和地區［33］。Yu等［34］建立羊鞭蟲病的早期診斷檢測方法，對于重組質粒，qPCR結果顯示每個反應的檢測限為31.7拷貝，而ddPCR能夠檢測到每個反應低于3.17拷貝的濃度。

2.4 dPCR在動物疫病檢測其他方面的應用

在標準物質研制領域，生物標準物質的研制逐漸成為研究熱點，同時基于核酸檢測技術的開發與應用推動了核酸標準物質的進程。核酸標準物質即為用于核酸擴增技術的標準物質，是生物標準物質的一種。核酸標準物質在醫療診斷、轉基因檢測、生物安全等方面有著極大的發展空間。標準物質具有通用屬性，可以用于定性檢測，也可以用于定量檢測。核酸標準物質需要高級別精準的定值方法，數字PCR作為單分子定量技術得到了廣泛的應用。與qPCR不同，dPCR不需要依賴分析樣品和參考標準品間的標準曲線進行絕對定量分析，并可用于qPCR測定參考標準品絕對定量［35］。國內已有研究通過數字PCR法制備出了豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬塞內卡病毒、非洲豬瘟病毒等國家二級標準物質［36-39］。采用高精確度的數字PCR技術替代熒光定量PCR技術進行定值，充分保障了定值結果的可靠性和技術權威性。此外，dPCR被越來越多地用于定量分析包括單核苷酸多態性（SNP）在內的序列變異，用于檢測稀有基因序列，分析藥物敏感性和進行人畜共患病篩查。

3 存在的問題及發展趨勢

目前，數字PCR技術依靠其絕對定量的技術優勢已經在各個領域嶄露頭角，但是也面臨一些挑戰。多路熒光通道方法依賴特定的平臺，dPCR平臺以及擴增混合物試劑的選擇可能會受到限制，具體取決于可用的商用儀器。盡管dPCR優于qPCR，但它不可能在臨床實驗室中完全取代qPCR。一些研究表明，在高核酸濃度下dPCR可能變得飽和，因此其性能比qPCR差，這強調了適當稀釋的重要性［40-41］。多重PCR是在一個樣本中可以獲得各種信息的方式，可充分利用極少量的和難以獲得的生物樣品，尤其是臨床樣本，減少病例的痛苦及經濟負擔。目前，伯樂QX200檢測通道可覆蓋雙通道（FAM/HEX），新推出的QX ONE系統配備4個獨立的熒光檢測通道檢測；BioMarkHD選配IFC微液流芯片（耗材）-Digital Array最多能兼容4種熒光染料進行多通道PCR；QuantStudio 3D系統支持多色熒光系統（FAM/VIC）；Naica數字PCR系統已經在多重方面使用了三通道技術；關于更多通道的需求各大廠商也在繼續研發中。

目前，另外一個弱勢是新技術使用的接受度，成熟方法以qPCR為主，傳統數字PCR方法和qPCR方法相比，操作太過復雜和獲得數據時間更長，耗材成本高。因此，一些實驗室僅使用dPCR進行標準品的精確定量，而qPCR仍然是常規技術。迄今為止，dPCR在傳染病，尤其是動物疫病診斷中的臨床應用仍不廣泛。根據大多數研究，相對于qPCR，dPCR帶來的最積極的改進是，dPCR提供了無標準曲線的絕對定量分析，對低負荷DNA更為敏感。一些證據表明，dPCR測定法在瘧疾控制程序領域或輸血醫學領域有望用于無癥狀和低密度感染中的寄生蟲血癥測定［42］。dPCR的技術缺點較少，但是迄今為止，當前dPCR平臺的更大復雜性、較少的通量阻止了它在常規實驗室中的應用。這需要儀器公司和研究人員對dPCR分析進行最佳配置規劃，以克服當前在動物臨床實驗室中實施的局限性。伴隨技術的發展，數字PCR成本必將逐漸降低，被大家廣泛應用。

4 結語

隨著dPCR技術與儀器的不斷發展與創新，以及大量成熟產品上市應用，可以合理地預期，一旦技術變得更加普及，dPCR的設備和試劑的成本（目前高于qPCR的成本）將大大降低，更加簡便、敏感、特異、高效以及可檢測潛伏感染的dPCR分子診斷手段將是未來疫病檢測診斷的發展趨勢。