內蒙古錫林郭勒盟犢牛腹瀉大腸桿菌的分離鑒定及藥物敏感性試驗

王 娜，戴伶俐，烏云塔娜，鋼托亞，趙世華，達來寶力格

（1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；2.呼倫貝爾市新巴爾虎右旗動物疫病預防控制中心，內蒙古 新巴爾虎右旗 021300）

近年來，我國出臺了許多畜牧業扶持政策，推動畜牧業迅速發展，牛產業成為畜牧業發展的重點。犢牛群作為牛場的后備力量，其健康與否直接影響牛場的整體經濟效益。犢牛腹瀉是危害犢牛健康生長的最常見疾病。據文獻報道，我國大部分省份的規模化養牛場幾乎都有犢牛腹瀉發生，給養殖場造成經濟損失。

大腸桿菌是引起犢牛腹瀉的主要病原，1～3日齡犢牛易感，發病初期常表現為腹瀉、脫水、生長緩慢，嚴重者可致死［1］。2015年新疆4個地區6個養殖場有千余頭犢牛因腹瀉死亡，發病率高于40%，死亡率高于50%，經實驗室檢測病原菌為大腸桿菌，大多數菌株攜帶鞭毛及腸毒素基因［2］；2017年1月新疆博樂牛場的30日齡以內的犢牛出現腹瀉癥狀，該牛場犢牛腹瀉的發病率為73%，死亡率為35%，并從新鮮的糞便樣品中分離到6株大腸桿菌，1株大腸桿菌（XJ-B1）可使小鼠產生腹瀉及死亡癥狀，且XJ-B1為多重耐藥菌［3］；2017年9月黑龍江某牛場2～14日齡犢牛出現腹瀉癥狀，發病率為5%，死亡率為100%，經實驗室診斷該病原為大腸桿菌和A型產氣莢膜梭菌［4］；2018年河北某牛場犢牛出現腹瀉癥狀，經實驗室檢測該病原為大腸桿菌［5］；2019年內蒙古通遼市某牛場出現犢牛腹瀉病，經實驗室檢測確定病原為大腸桿菌，血清型為O17，且為多重耐藥菌［6］；2019年贛西某肉牛養殖場的犢牛出現腹瀉癥狀，發病率為60%，經臨床和實驗室診斷確定該病原為大腸桿菌，該菌對環丙沙星較敏感，治療后數日無新增病例［7］。

該研究從腹瀉犢牛的肛拭子中分離到2株大腸桿菌，并對分離菌進行了鑒定和藥物敏感試驗，為后期的群體治療提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1病料在內蒙古錫林郭勒盟多倫縣某養殖場采集2頭腹瀉犢牛的肛拭子樣品2份，裝入采樣袋，依次編號為XM-GSZ-1、XM-GSZ-2，低溫保存。

1.1.2主要試劑伊紅美藍瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基購自廣東環凱有限責任公司；35種藥敏片購自杭州濱和微生物有限責任公司。

1.1.3實驗動物體重為25 g健康昆明小鼠18只，由內蒙古大學實驗動物中心提供。

1.1.4主要儀器生化培養箱SPX-16B購自吉林省安可有限責任公司；恒溫水浴鍋SH-WB-6GDN3購自韓國三興有限責任公司；恒溫搖床TS-2112B購自上海比朗儀器制造有限責任公司；渦旋振蕩器VM-10購自大韓科學有限公司；PCR儀ABI9902購自美國伯樂有限責任公司；電泳儀HE99X購自美國伯樂有限責任公司；全自動凝膠成像儀購自Type T2A美國伯樂有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1細菌分離培養在無菌條件下將肛拭子分別接種于伊紅美藍瓊脂培養基、麥康凱瓊脂培養基，37℃培養16～24 h，觀察菌落形態、顏色及菌體形態。將革蘭陰性桿菌菌落轉接于LB液體培養基中，37℃培養16～24 h，取1 mL菌液提取基因組，剩余菌液保種。

1.2.2菌株鑒定

1.2.2.1表型鑒定大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂培養基上為圓形紫黑色大菌落，表面光滑濕潤，并有典型的金屬光澤；在麥康凱瓊脂培養基上為圓形微紅色菌落，中心為桃紅色，周圍呈渾濁圈，表面光滑整齊。

1.2.2.2生理生化鑒定通過硝酸鹽還原試驗、VP試驗、MR試驗及糖發酵等試驗進行大腸桿菌生理生化鑒定［8］。

1.2.2.316Sr DNA鑒定使用細菌基因組提取試劑盒提取大腸桿菌DNA，-20℃保存。參考文獻設計引物27F和1492R［9］，送至上海生工生物有限責任公司合成。以27F和1492R為引物進行PCR擴增，PCR反應條件：94℃，5 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，90 s，30次循環；72℃，7 min。PCR產物送到上海生工生物有限責任公司測序。使用NCBI或EBI比對序列，利用軟件MegAlign構建菌株系統發育樹。

1.2.3大腸桿菌分型鑒定參照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）［10］設計大腸桿菌分型引物。

1.2.4小鼠毒力測定挑取純化菌落接種于3 mL LB液體培養基，37℃培養16～18 h，12 000 r/min離心2 min，棄上清，用0.85%的生理鹽水洗菌3次，并將菌濃度調至5×108CFU/mL，腹腔注射200 μL/只。每組6只小鼠，雌、雄各半，觀察1周。

1.2.5藥敏試驗使用35種藥敏片進行體外抑菌試驗，每種藥敏片設置3個重復，參考CLSI（2009）標準進行結果判定［11］。

2 結果與分析

2.1 菌株培養特性

該試驗從2份肛拭子中分離到2株大腸桿菌（XM-GSZ-1、XM-GSZ-2），這2株菌株在伊紅美藍瓊脂培養基上為圓形紫黑色大菌落（見圖1A和圖1B），直徑1～2 mm，表面光滑濕潤，并有典型的金屬光澤；在麥康凱瓊脂培養基上呈圓形微紅色菌落（見圖1C和圖1D），中心為桃紅色，周圍呈渾濁圈，直徑2～4 mm，表面光滑整齊。

圖1 分離菌株菌落形態

2.2 菌株鑒定

2.2.1菌株生理生化鑒定菌株生理生化鑒定嚴格按照細菌新型生化鑒定管使用說明書進行操作。由表1可知，這2株菌MR試驗和硝酸鹽還原試驗為陽性，VP試驗、苯丙氨基酸羧酶試驗為陰性，且具有運動性，參照伯杰細菌鑒定手冊，這2株菌符合大腸桿菌的理化特性，初步判定為大腸桿菌。

表1 菌株生理生化鑒定

2.2.2菌株16Sr DNA鑒定以菌株XM-GSZ-1和XM-GSZ-2基因組DNA為模板進行PCR擴增，獲得1 500 bp的擴增產物（見圖2），經上海生工生物有限責任公司測序，通過NCBI比對構建系統發育樹（見圖3）及進行同源性分析（見圖4）。同源性分析可知，分離株XM-GSZ-1與MT649857.1 Escherichia coli stain的相似度為99.2%，與MN094119.1 Escherichia coli strain的相似度為98.4%；XM-GSZ-2與MN094119.1 Escherichia coli strain的相似度為100%，與MT649857.1 Escherichia coli strain的相似度達到99.1%，因此，鑒定這2株菌株為大腸桿菌，且分離的這2株大腸桿菌的同源性為98.1%。

圖2 菌株PCR產物擴增電泳圖

圖3 菌株系統發育樹

圖4 菌株序列同源性分析

2.2.3菌株大腸桿菌分型引物鑒定由圖5可知2株大腸桿菌均含有It基因和stp基因，依據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）［10］，確定該2株腹瀉大腸桿菌為ETEC型（產腸毒素大腸埃希菌）。

圖5 菌株ETEC分型引物擴增電泳圖

2.3 小鼠毒力鑒定

攻毒后12 h，小鼠精神呆滯，被毛粗亂，呼吸困難。菌株XM-GSZ-1試驗組在攻毒后14 h有2只小鼠出現死亡，菌株XM-GSZ-2試驗組在攻毒后12 h有2只小鼠死亡，72 h內12只小鼠全部死亡，對照小鼠未出現任何臨床癥狀，因此，判定這2株大腸桿菌為強毒株。

2.4 體外藥敏試驗

體外藥敏試驗顯示（見表2），這2株菌對氨芐西林、氨曲南、頭孢唑啉、四環素、氧氟沙星、左氧氟沙星、復方新諾明等21種藥物表現為耐藥；對頭孢哌酮、頭孢曲松、克林霉素、多黏菌素B、米諾環素等10種藥物表現為中度敏感；對頭孢西丁、萬古霉素、環丙沙星及呋喃妥因4種藥物表現為敏感。

表2 分離菌株體外藥敏試驗結果 單位：mm

3 討論

該試驗通過菌株分離培養、生理生化試驗及分子生物學技術確定該菌為大腸桿菌。根據《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》（GB 4789.6—2016）［10］確定分離菌株為產腸毒素致病性大腸桿（ETEC）。ETEC是一種常見的引起人畜腹瀉的致病性大腸桿菌，且是養殖場腹瀉的最常見病原菌［12］。研究發現，ETEC主要依靠菌毛定殖于腸道黏膜，然后經腸毒素的作用，使腸道產生炎癥損傷，宏觀癥狀為腸黏膜完整性被破壞，微觀癥狀為腸黏膜上皮細胞脫落、白細胞等炎癥細胞明顯增加，從而引發犢牛腹瀉脫水，對犢牛的生長發育造成不利影響，嚴重者可致死［13-14］。另外，也有研究表明ETEC感染幼畜的嚴重程度常取決于日齡、自身狀況、生活及飲食環境等，食物傳播是主要的傳播途徑，犢牛因誤食污染的草料、水等引發感染［15］。有研究表明，新生犢牛出生12 h內，推遲攝取初乳，會減少IgG在機體的被動轉移，能延遲腸內細菌的定植，使犢牛斷奶前免受致病菌感染［16］。

考慮養殖場濫用抗生素的實際情況，細菌極可能產生耐藥性，所以該試驗設計體外藥敏試驗。分離菌株對21種藥物表現為耐藥性，對頭孢西丁、萬古霉素、環丙沙星及呋喃妥因4種藥物表現為敏感，臨床治療過程中，使用環丙沙星能獲得較好的效果。