PCR技術在動物源性成分檢測中的應用

付莎莉 王利剛 張 婧 周正海 陳 欣 費云滟 吳 丹

重慶市食品藥品檢驗檢測研究院 重慶 401121

動物源性食品因其含有豐富的人體必需營養物質，成為人們飲食構架中必不可少的組成部分。隨著社會發展和消費升級，人們對各種動物源性食品的數量、質量的需求都在增長[1]。實際生產中，不同品種肉類因養殖成本、物流成本等因素影響，其產品銷售價格差異較大，一些不法商販在肉類及其制品中摻雜摻假牟取暴利。肉類摻假不僅影響市場經濟秩序，破壞食品營養價值，還存在消費者因食用未標示的肉類原料產生過敏反應的健康問題[2]，以及宗教信仰問題等[3]。肉制品特別是深加工肉制品僅靠感官和肉類形態學為主的鑒別方法，無法準確鑒別其種類和品質，而基于核酸水平的PCR技術可高效、準確檢測食品中的動物源性成分，現將PCR及其衍生技術在動物源性成分檢測中的應用進展綜述如下，以期為食品監管技術手段的選擇提供參考。

1 PCR技術原理及其衍生方法

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)可以在生物體外將DNA片段準確有效進行復制，實現DNA片段數量大幅度增加。實際工作中，只要能夠從樣品中提取出微量的DNA，就可以直接利用PCR技術進行擴增，通過對目標DNA片段進行分析比對，便可以獲得樣品所屬物種的信息。隨著使用需求的不同，沿用不同的使用條件，PCR技術已經衍生出了多種應用方法，下面就近年來在食品動物源性成分檢測中常用的實時熒光PCR法和數字PCR法進行闡述。

1.1 實時熒光PCR法

實時熒光PCR(Real-Time PCR)技術在常規PCR技術基礎上，可通過監測PCR擴增過程中熒光染料或特異性標記探針造成的熒光信號的改變，實現對目標DNA的檢測[4]。實時熒光PCR法在動物源性成分的檢測中的關鍵在于針對檢測目標，選擇適宜的熒光標記基團來設計特異性引物。而熒光探針Real-Time PCR技術，還需要設計熒光探針序列。表1列出了豬、牛、羊、雞、鴨、鵝的引物和探針序列，在肉類鑒別檢測中熒光報告基因往往需要具有較強的特異性，特異性熒光報告基因主要包括線粒體基因DNA、細胞基因組中重復序列和單拷貝序列。Real-Time PCR在動物源性檢測中的應用如下。

1.1.1 單重熒光探針法

Zhang[9](2007)等以牛線粒體Cyt b基因為分析對象設計了特異性引物和Taqman熒光探針來檢測熱處理后的純肉中牛源性成分及含量，該方法牛DNA最低檢出限為35 pg，且未顯示與綿羊、山羊或豬的DNA有交叉反應，特異性高。Ali[10](2012)等以豬線粒體Cyt b基因作為分析對象設計了Taqman熒光探針來檢測混合肉中是否含有豬源性，該方法檢出限低至0.01%，可應用于檢測肉制品中是否有豬肉添加。Miguel[11](2005)等以豬線粒體12S rRNA基因作為分析對象設計了豬源性特異性引物，擴增豬肉DNA的411 bp片段，同時擴增幾種來自哺乳動物物種DNA的425～428 bp片段用作內源性干擾，結果顯示未與其他動物DNA產生交叉反應，該檢測方法對豬肉定量檢測的靈敏度范圍為0.5%～5%。

Yusop[12](2012)等以豬的Cyt b基因作為分析對象設計引物和分子信標探針，建立了Real-Time PCR體系，以多種生肉混合物為樣品，檢測結果顯示出高特異性，其中豬肉的定量檢出限為0.001ng，而其他肉類品種均為陰性。Mohanad[13](2018)等以豬的染色體DNA和Cyt b基因為研究對象設計了引物和分子信標探針，用于明膠制品中豬源性成分的定量檢測，結果顯示基于Cyt b基因的檢測方法可檢測出體系中10pg的豬DNA，而基于染色體DNA基因的檢測方法可檢測出體系中1pg的豬DNA。

1.1.2 多重熒光探針法

多重熒光探針法即在Real-Time PCR技術的基礎上利用多對引物測定，在動物源性檢測中也有較廣泛的應用。Iwobi[14](2015)等選擇β-肌動蛋白基因和肌肉生長抑制素基因為分析對象，設計引物和Taqman探針，采用三重Real-Time PCR用于定性和定量檢測混合肉中牛源性和豬源性成分，結果表明該引物和探針未與其他動物DNA產生交叉反應，定量范圍為0.5%～99.5%，檢出限為20bp。章晶晶[15](2017)等選擇貉子線粒體D-loop基因和狐貍的線粒體基因作為分析對象設計引物和探針，建立了多重熒光PCR體系對肉制品中狐貍、貉子源性成分定量分析，其中最低檢測限為狐貍0.5pg/μL、貉子5pg/μL。劉艷艷[16](2016)等選擇線粒體基因組16S rRNA基因為分析對象設計引物和分子信標探針建立的多重Real-Time PCR體系能實現對阿膠原料中驢、馬、驢騾和馬騾源性成分的同時區分，結果顯示建立的多重Real-Time PCR體系具有較好的物種特異性和檢測靈敏性，最低檢測限為0.01ng/μL。Mar[17](2012)等選擇t-Glu和Cyt b基因為分析對象設計引物和探針，檢測熱處理前后混合肉樣中豬、牛和雞肉的含量，最低檢出限為原樣1%、熱處理樣0.32pg/μL。Cheng[18](2014)等選擇β-肌動蛋白基因和生長因子基因設計引物和Taqman-MGB探針建立多重熒光PCR體系檢測雞、鴨和豬源性成分在混合DNA中的含量，并以鵝、馬、兔、牛、驢、鯽魚、綿羊和山羊8種源性成分作為陰性對照，結構顯示該方法具有很強特異性，未產生交叉反應，檢測限可達到0.15ng。Druml[19](2015)等選擇偽表皮生長因子基因設計Taq man-MGB探針和體系，以鑒別混合肉類DNA中三種鹿的含量，該方法顯示出較高特異性，未與肉類產品中可能含有的其他20種動物和43種植物成分產生交叉反應，檢測為0.1%。許如蘇[20](2017)等選擇線粒體基因組為研究對象設計引物及探針，建立了多重Taqman-LNA熒光PCR體系，實現肉制品中豬雞鴨源性成分的同時檢測，且與牛、羊、驢、兔、鵝等常見動物源性成分無交叉反應，特異性高，且其檢測限均可低至肉含量的0.001%，靈敏度強。

1.1.3 熒光染料法

熒光染料是能與ds DNA雙螺旋小溝區域非特異性結合的染料，在激發光的作用下結合狀態染料的熒光強度遠遠高于游離狀態的熒光強度，其熒光信號強度隨擴增過程中PCR產物的增加而同步增強，以Sybr Green和EvaGreen較為常見。Soares[21](2013)等以Sybr Green作為熒光染料，選擇豬的Cyt b和18S rRNA基因為分析對象設計引物，該方法表現出良好特異性，在豬肉添加量0.1%～25%的混合肉樣中檢測豬肉的含量，結果表明豬DNA在原樣中最低檢出量為5pg、熱處理樣中最低檢出量為20ng。郭云霞[22](2012)等選擇真核生物18S rRNA為對象設計引物，以SYBR Green I為熒光染料用Real-Time PCR方法檢測了多種動植物食品樣品中的鯊魚源性成分，該方法的檢出限為0.001ng/μL；Kang[23](2018)等則采用Subr Green染料的Real-Time PCR技術，在100%～0.01%范圍內對豬肉和牛肉混合樣品中豬肉的含量進行測定，經驗證比較得出該方法可以用于檢測牛肉加工制品中是否有豬肉摻假。Lubil[24](2018)等選擇豬的Cyt b基因為對象設計引物，建立了采用EvaGreen為熒光染料的Real-Time PCR方法來檢測肉制品混合物中豬DNA的含量，并且通過9種其他動物和6種蔬菜為陰性對照，證明了該方法對豬DNA具有特異性。該法在檢測生豬肉和雞肉混合物時檢出限可低至0.001%。同樣以Cytb基因為對象進行新引物設計，Meira[25](2017)等建立了定性定量檢測體系檢測加工食品中馬肉摻假，該方法表現出高靈敏度和特異性，在牛和馬的混合樣品的檢測中，最低可檢測到的馬DNA為0.1pg。Joana[26](2017)等采用EvaGreen熒光染料建立定量檢測體系，通過熔解曲線于標準曲線的比對對肉制品中豬肉含量進行定量檢測，并利用未知肉混合物進行重復驗證，得出該方法特異性較強、重復性高，豬DNA的最低檢出限為0.01pg。Sakalar[27](2015)等選擇豬和馬的12S rRNA和16S rRNA基因為對象設計引物，EvaGreen為熒光染料建立了多重Real-Time PCR技術，可實現在0.1%～10%范圍內對混合肉中馬和豬肉的含量進行同時檢測，檢出限低至0.00001ng/μL。Sakalar[28](2016)等還設計了基于EvaGreen的雙重Real-Time PCR檢測體系來檢測肉制品中豬肉和牛肉摻假，該體系異性強，靈敏度可達0.001%。

1.2 數字PCR法

單一的Real-Time PCR技術雖能實現相對定量，但需要建立已知拷貝數的標準曲線才能比對出目標序列的拷貝數，而檢測結果受擴增效率的影響較大，所以該方法不能對目標序列精確定量，而數字PCR技術的出現實現了核酸的絕對定量。數字PCR的快速發展得益于微流控技術的逐漸成熟，先后發展出基于微反應腔室、集成化微流控芯片和微滴技術的數字PCR系統[29]，微流控芯片式數字PCR(cdPCR)技術通過將納升級的液體樣品封閉在由多個獨立的微池或微通道組成的集成芯片后，進行PCR擴增，并根據不同微池或微通道的熒光信號情況判讀。微滴數字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是一種利用水油乳化液滴系統進行數字PCR的方法[30～33]。兩者中微滴數字PCR具有一定優勢，以下重點介紹微滴數字PCR的應用。

Cai[34](2014)等通過應用微滴數字PCR技術，對豬肉和雞肉產品進行定量分析，研究結果表明，肉質量與DNA含量、DNA含量與DNA拷貝數量之間均呈線性關系。在此基礎上，建立了根據DNA拷貝數計算肉質量的模型。并通過人工比例污染試驗，混合已知比例的豬肉和雞肉，以驗證該方法的準確度和適用性，獲得了較好的驗證結果。該團隊于2017年通過應用雙微滴數字PCR技術，對肉制品中牛肉源性和豬肉源性成分進行檢測，并進一步定量。該方法實現了在一個數字PCR反應管內同時對牛肉和豬肉混合樣品中的源性成分進行識別和定量，同時，通過已知比例成分的混合肉類樣品驗證了該方法的準確性和適用性[35]。該團隊于2018年通過應用微滴數字PCR技術，對肉制品中山羊肉和綿羊肉含量的檢測和定量進行了研究，建立了一套基于DNA拷貝數的肉質量計算模型。并使用不同動物品種(24種)的樣本進行了專一性的驗證，其中包括山羊和綿羊每個種屬各5個品種。方法采用含有山羊和綿羊特異基因片段的質粒作為正對照用于校正，方法結果顯示山羊和綿羊的檢出限和定量限分別為1 copies/μL和5 copies/μL。采用將山羊和綿羊肉按比例混合的模擬樣品進行了準確性和適用性的驗證。結果顯示該方法具有很高的精確度，具有較好的應用前景[36]。

Floren[37](2015)等以真核生物核F2基因作為目標靶點，開發了一種兩步式微滴數字PCR方法，用于檢測肉制品加工過程中牛、馬、豬源性成分的含量并與熒光定量PCR法進行比較，結果表明微滴數字PCR法更具有優勢，定量限低至0.01%，檢出限為0.001%。并采用了14種物種驗證其特異性，未顯示出交叉反應。Ren[38](2017)等通過采用微滴數字PCR方法對綿羊、山羊為原料的肉制品中的雞肉含量進行定量檢測，該方法在檢驗計算過程中引入倍數因子，將擴增拷貝數的比例換算為肉源性含量的比例，該法對經過熱處理和超高壓處理后的樣品同樣具有較好的重復性和穩定性，且原料動物不同部位采樣對該方法的精確度無影響。

Noh[39](2019)等建立了一種用于定量分析海產品中阿拉斯加鱈魚含量的微滴式數字PCR方法，確立了魚肉質量、DNA含量和DNA拷貝數量之間的線性關系，在此基礎上建立了以DNA拷貝數為計算基礎的肉質量計算模型。通過對已知比例混合樣品進行定量分析驗證了其準確性和適用范圍。結果顯示，該方法可用于海產品中阿拉斯加鱈魚的檢測及定量分析，可應用于產品質量及真實性認證。史艷宇[40](2018)等以鴨線粒體基因為目標靶點設計引物和探針，通過微滴數字PCR進行擴增檢測和分析，建立了產品中鴨源性成分的檢測和定量分析方法，與熒光定量PCR比較后得出該方法靈敏度高于熒光定量PCR。

2 研究展望

目前對肉類源性的鑒別檢測主要集中在對蛋白質的檢測和對核酸的檢測兩方面。但是蛋白質檢測的開展需要高要求的儀器和樣品前處理方法，前處理復雜、試劑成本高、耗時長、特異性較差，且往往不適用于經熱加工處理的肉制品，僅適用于對新鮮肉類的檢測。而基于核酸的檢測方法更具優勢，通過對數據庫內已知種類特異DNA序列的比對判定樣品種類，更適用于檢測未知樣品。

Taqman熒光探針在實際實驗中存在一定的局限性，無法應對靶基因特異序列較短的情況。對體系中存在的與靶基因同源的序列，也很容易出現非特異性擴增，造成最終定量不準確。分子信標靈敏度強，可檢測出單個核苷酸的突變，可以應對靶基因特異序列較短狀況，但其設計要求復雜，且成本較高[24]。熒光染料法可用于dsDNA序列的擴增監測，相對熒光探針法設計要求簡單，成本低。基于Real-Time PCR技術具有特異性強、靈敏度高、操作便捷的特點，近年來廣泛應用于快速定量檢測，在食品檢測領域更是具有較高的應用價值。利用Real-Time PCR技術為基礎，大量研究建立了畜禽產品、水產制品、奶制品的檢測方法，可應用于肉類摻假、奶制品摻假的鑒別。采用Real-Time PCR技術時仍需注意：熒光染料法雖然檢測簡便、價格便宜，但染料與DNA雙鏈的結合為非特異性結合，往往會出現多個終產物，則需要通過擴增曲線的判斷來確定多個終產物的特異性[38]。熒光探針法比熒光染料法具有更強的特異性，但至關重要的目標基因選擇以及引物探針設計還較為困難，若體系中存在與靶基因同源的序列，則易出現非特異性擴增，使得定量不準確。數字PCR法是近幾年才新出現的技術，可以檢測出混合復雜樣品中的微量核酸，靈敏度極高，且可以實現核酸的絕對定量。因其具有的明顯優勢已在成分鑒定檢測領域快速發展，在動物源性食品成分檢測中也具有重要作用。

數字PCR技術的應用，使很多動物源性食品摻假制假的研究，從以往片面的定性檢測實現了精準定量檢測的跨越，檢測數據能反應混合樣品中不同動物源性材料的含量，進一步掌握動物源性制品摻假程度。現階段微生物檢測領域和植物轉基因檢測領域已經制定了相關方法和標準，但在動物源性成分檢測方面檢測方法標準仍空缺，所需試劑和ddPCR儀器價格居高不下，造成了ddPCR在常規實驗室普及率低。未來隨著國家監管投入增加和設備價格的降低，微滴數字PCR將更加普及，成為動物源性食品監管的檢測技術支撐。