基于質控圖聯合Westgard多規則理論的替考拉寧血藥濃度監測的室內質控評估

陳 明，唐原君*，王倩茹，唐晶晶，石晨陽

0 引言

替考拉寧(Teicoplanin)又稱肽可霉素，由游動放線菌屬發酵產生。其作用機制與萬古霉素相似，與細菌細胞壁肽聚糖前體分子結合，抑制細胞壁的合成，從而抑制或殺滅細菌[1-2]。研究表明，替考拉寧的抑菌效應與其達到最低抑菌濃度和抗菌后效應有關，提示了替考拉寧血藥濃度監測的重要意義[3-4]。替考拉寧藥品說明書2018版也指出，在完成負荷劑量治療方案后，在穩態時監測替考拉寧濃度，有助于確保達到最低血清谷濃度，表明替考拉寧血藥濃度監測的必要性已經得到共識[5]。替考拉寧為糖肽類抗生素，主要由5個結構類似的化合物組成(TA2-1、TA2-2、TA2-3、T2-4、TA2-5)，其中TA2-2為主要組分，占各組分總含量的40%～60%。當臨床上檢測濃度較低時，會出現TA2-1、TA2-3、T2-4和TA2-5的峰，有可能還會出現這4個峰和其他雜質峰達不到有效分離[6]。有文獻報道采用TA2-2峰的峰面積定量與采用5種成分的峰面積加和定量，其結果并無臨床顯著差異[7]。

考慮以上因素，本實驗室建立了測定人血清中替考拉寧(TA2-2峰)濃度的高效液相色譜法(HPLC)，并應用于臨床血藥濃度監測。為保證替考拉寧血藥濃度監測結果的準確性和可靠性，現對2019年1-6月室內質控結果進行回顧性分析，以確保替考拉寧的血藥濃度監測質量，為臨床醫師使用和調整替考拉寧治療方案提供實驗室依據，保證臨床安全、有效地使用替考拉寧。

1 材料

1.1 儀器 SHIMADZU LC-10AD高效液相色譜儀(SHIMADZU，美國)，包括LC-10AT色譜泵，SIL-10AD自動進樣器，CTO-10AS柱溫箱，SPD-10A檢測器；HY-5渦旋混合器(SI公司，美國)；Centrifuge 5804R冷凍離心機(Eppendorf公司，德國)；AL104-01電子分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)；CPA2250電子分析天平(賽多利斯，德國)；SK7200H超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)；Hitech-Kflow水純化系統(18.2 MΩ)(上海和泰儀器有限公司)等。

1.2 試藥 替考拉寧對照品(純度：每毫克相當于894單位，中國食品藥品檢定研究院，批號：130374-201002)；富馬酸喹硫平對照品(大連美侖生物技術有限公司，批號：N1102AS，純度：>98%)；磷酸二氫鈉(上海凌峰化學試劑有限公司，分析純)；甲醇(Merck，HPLC級)；乙腈(Merck，HPLC級)；二氯甲烷(上海凌峰化學試劑有限公司，分析純)；磷酸(分析純)；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 工作溶液配制 精密稱取替考拉寧標準品20.36 mg，置于10 ml棕色容量瓶中，加水溶解并定容，配制成濃度為2.036 mg/ml的標準品儲備液。4 ℃避光保存。精密稱取喹硫平標準品8.18 mg，置于50 ml棕色容量瓶中，加水溶解并定容，配制成0.16 mg/ml內標儲備液，4 ℃避光保存。

2.2 血漿樣品及質控品處理方法 人血漿樣品及隨行質控樣品室溫下解凍后，分別取400 μl置于1.5 ml 塑料離心管中，加入50 μl內標工作液，混勻，加入600 μl乙腈沉淀，渦旋振蕩5 min，于13 000 r/min離心5 min。取上清液900 μl置于另一1.5 ml EP塑料離心管中，加入400 μl二氯甲烷，渦旋振蕩5 min，于13 000 r/min離心5 min。取上清液200 μl置于進樣器中自動進樣20 μl，進行LC-UV分析。

2.3 色譜條件 分析柱：Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；內標：喹硫平；柱溫：35 ℃；流動相：0.01 mol/L NaH2PO4(pH 2.7)-乙腈(76∶24)；流速：1.0 ml/min；進樣量：20 μl；檢測波長：240 nm。典型色譜圖見圖1。由圖1可見，空白血漿在替考拉寧和喹硫平出峰處無明顯雜質峰干擾，替考拉寧和內標的保留時間分別為8.41 min和12.62 min。

圖1 人血漿中替考拉寧高效液相色譜圖注：A.空白血漿，B.替考拉寧對照品，C.內標喹硫平對照品，D.患者滴注替考拉寧達穩態后的血漿樣品。1.替考拉寧，2.喹硫平

2.4 室內質量控制

2.4.1 線性范圍評價及定量下限(LLOQ) 配制濃度為101.80、50.90、25.45、12.72、6.36、3.18 mg/L的替考拉寧血漿樣品，每一濃度各3份，按“2.2”項下操作，記錄替考拉寧和內標峰面積，以替考拉寧濃度(mg/L)為橫坐標，替考拉寧TA2-2峰面積(A)與內標峰面積(AI)的比值(A/AI)為縱坐標，采用加權最小二乘法進行兩者線性回歸運算，得到標準曲線方程為y=0.03 062 x-0.013 14 (R2=0.999 8)，結果表明，人血漿中替考拉寧濃度在3.18～101.80 mg/L范圍內具有良好的線性關系。配制替考拉寧定量下限3.18 mg/L血漿樣品5份，按“2.2”項下操作，計算得替考拉寧定量下限信噪比大于10，RSD小于2%，RE小于10%。

2.4.2 準確度和精密度 配制低、中、高3種濃度(3.77、11.31、33.93 mg/L)的替考拉寧質控樣品，每個濃度的樣品平行制備5份，按“2.2”項下處理，記錄替考拉寧和內標峰面積。按標準曲線回歸方程計算濃度，對比求得日內精密度。連續測定3 d，考察方法的日間精密度。測定濃度與理論濃度對比，求得準確度。結果見表1。

表1 HPLC法測定替考拉寧的方法回收率和精密度

2.4.3 提取回收率評價 配制低、中、高(L、M、H) 3個濃度的替考拉寧血漿質控樣品各5份，同時配制低、中、高(L、M、H) 3個濃度的不含血漿質控樣品各5份，按“2.2”項下處理，記錄替考拉寧和內標峰面積，將相應濃度的替考拉寧血漿樣品峰面積與不含血漿質控樣品峰面積進行對比，計算提取回收率。見表1。同理，計算內標喹硫平提取回收率為94.82%。

2.4.4 穩定性考察 配制低、中、高 3 個濃度(3.77、11.31、33.93 mg/L)的替考拉寧質控樣品各5份，置于不同條件下進行穩定性考察：凍融穩定性，樣品反復凍融3次；室溫穩定性，樣品室溫放置24 h；進樣器放置24 h穩定性，樣品按前處理方法處理后，在進樣盤內放置24 h。質控樣品按上述條件處理后，以測得值與真實值比較，偏差均小于15%。結果表明，樣品在反復凍融3次、室溫放置24 h、進樣器放置24 h條件下均穩定。

2.5 回顧性質量控制

圖2 替考拉寧低、中、高濃度質控品 Levey-Jennings 質控圖

圖3 替考拉寧低、中、高濃度質控品 Z-分數質控圖

3 討論

治療藥物濃度監測對于臨床合理用藥、減少不良反應的發生具有重要意義，而測定結果的準確性和穩定性是制定個體化給藥方案的重要前提[14]。室內質控是保證臨床實驗室發出高質量報告的基本要求。根據我國頒發的《臨床實驗室質量管理辦法》中要求，室內質量控制為檢驗人員按照一定的頻度連續測定穩定樣品中的特定組分，并采用一系列方法進行分析，按照統計學規律推斷和評價本批次測量結果的可靠程度，以此判斷檢驗報告是否可發出，及時發現并排除質量環節中的不滿意因素[15]。目前，大多數藥學人員開展治療藥物濃度監測工作尚未執行統一質量控制標準，國內外HPLC 監測血藥濃度的室內質量控制研究尚不完善，且所用質控品均為自行配制。關于替考拉寧血藥濃度監測的室內質控研究尚未見報道，因此，本研究在已有實驗室條件下，對HPLC法測定替考拉寧血藥濃度的室內質量控制評價體系進行了相關探索。

室內質量控制活動中經常使用Levey-Jennings圖和Z分數質控圖來監測檢測結果的誤差是否在可接受的范圍。Levey-Jennings質控圖主要用于同一濃度水平質控品的精密度比較，但不適用于判斷準確度；而Z分數質控圖可以將不同濃度水平質控品進行標準化后繪制在同一張質控圖上，通過單值質控圖連續評價實驗室的質量控制能力[18-19]。觀察上述質控圖，可以看出Z分數質控圖的低、中、高濃度質控品測定值在不同時間點的變化趨勢與Levey-Jennings質控圖保持一致。將Levey-Jennings質控圖與Z分數質控圖聯合Westgard多規則理論，可以降低假失控和假報警率，從而呈現室內質控的準確性。

本文采用Levey-Jennings圖和Z分數質控圖，結果顯示，替考拉寧血藥濃度監測的室內質控分析結果均在誤差允許范圍內，保證了血藥濃度測定的準確性和可靠性，具有較好的臨床指導意義。本實驗室在日常治療藥物濃度監測工作中通過及時繪制質控圖進行監測，可以及時發現質控測定中出現的漂移、趨勢性變化、失控等問題，也可及時發現影響測定結果準確性的潛在因素。有助于實驗人員判斷誤差類型并排除誤差原因，增加血藥濃度監測結果的可靠性。