細胞遺傳學異常對硼替佐米療效的影響

蔡宜諾，劉景華，周 凡，王吉剛，田 華，劉麗欣，張 帆，劉彥琴，佟丹江，孟廣晗，張美玉

0 引言

多發性骨髓瘤(Multiple myeloma，MM)由于其高度的異質性，患者生存時間存在較大差異，而導致其異質性的重要因素之一為細胞遺傳學的異常。根據細胞遺傳學異常所發生的時間及在MM起病及疾病進展中的作用，分為原發異常及繼發異常。超二倍體和非超二倍體的改變均屬于原發異常，如常見的免疫球蛋白重鏈IgH的重排，而13號染色體缺失、17p13缺失、1p缺失、1q擴增及c-myc易位為常見的繼發異常[1]。細胞遺傳學的異常嚴重影響了患者的預后，因此，在ISS分期的基礎上，根據乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)及高危細胞遺傳學[17p-、t(4;14)、t(14;16)]，進一步將MM進行ISS-R危險分層[2]。為研究新診斷的多發性骨髓癥(NDMM)患者對硼替佐米治療的反應是否受細胞遺傳學異常的影響，本文回顧性分析2017年1月至2020年6月的110例接受以硼替佐米為基礎治療的NDMM患者的療效與細胞遺傳學細胞的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 對110例NDMM患者進行骨髓穿刺，均留取3 ml骨髓液，其中85例進行FISH檢測，8例患者因放棄治療、失訪等原因無法進行療效評估，最后選取77例可評估療效的病例進行分析。

1.1.2 主要實驗試劑 MACSprep MM CD138 MicroBeads (# 130-111-744)-CD138骨髓分選磁珠；Whole Blood Column Kit (# 130-093-545)-全血分選柱套裝；MACS BSA Stock Solution (# 130-091-376)；autoMACS?Rinsing Solution (# 130-091-222)；autoMACSTMRunning Buffer (# 130-091-221)；1∶20稀釋用于配制separation buffer或separation buffer；MACS?SmartStrainers,100 μm (# 130-098-463)。濾器：過濾骨碎片/骨髓脂肪顆粒/細胞團。探針：雅培，CYCTOCELL。卡諾氏固定液：乙酸和甲醇，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 CD38磁珠分選漿細胞 ①從抗凝管中取3 ml骨髓；②骨髓樣本處理：通過MACS?智能過濾器(100 μm)傳遞細胞，以去除骨碎片或細胞團塊；③在445×g下離心10 min，取出棄上清；④每1 ml抗凝骨髓或全血加入50 μl MACSprep多發骨髓瘤CD138微珠；⑤混勻，室溫下孵育15 min(19～25 ℃)；⑥進行磁選：將全血柱放置在合適的MACS分離器的磁場中，用3 ml分離緩沖液沖洗準備柱，將磁性標記的細胞懸液滴在制備的全血柱上，收集被標記的細胞，未標記細胞的流過；⑦用2×2 ml分離緩沖液沖洗全血柱；⑧從分離器中取出全血柱，放置在新的收集管上；⑨將4 ml全血柱稀釋緩沖液輸送到全血柱上，立即沖洗磁性標記的細胞，推動柱塞進入柱收集細胞；⑩將富集之后的細胞用卡諾氏固定液進行2次固定，制成細胞懸液，滴片，56 ℃老化2 h，進行清洗，探針雜交。

1.2.2 漿細胞FISH檢測 ①將新鮮骨髓液標本進行前期處理，取2 ml骨髓液，離心棄上清，經過濃度為0.075 mol/L低滲液進行低滲處理，再用卡諾氏固定液對低滲過后的懸液進行3次固定處理，制成細胞懸液。調制成適宜的細胞濃度進行滴片。②將滴好的玻片放入56 ℃的烤箱進行老化處理，時間為30 min～1 h。③將玻片從烤箱取出恢復至室溫后，浸入50 ml 2×SSC中各洗滌3 min，梯度脫水70%酒精、80%酒精、100%酒精各3 min，晾干(≤6個載玻片/缸)。④加相應檢測項目的探針標準用量在玻片上，先將探針試劑混勻后加于玻片雜交區域內，蓋上蓋玻片，膠(美國Vysis公司產品)封片后置于37 ℃原位雜交儀中雜交過夜。雜交后標本在(72±1) ℃，0.4×SSC/0.3%NP-40的洗液中洗滌5 min，待其溫度降下，將玻片浸入50 ml 2×SSC中，兩缸各1 min，梯度脫水70%酒精、80%酒精、100%酒精各1 min，晾干(≤6個載玻片/缸)。避光晾干后加二咪基苯基吲哚(DAPII)/抗淬滅劑(Vysis公司產品)復染。用蔡司(Iamger.A2)熒光顯微鏡，在熒光通道下觀察間期細胞的熒光雜交信號，至少分析200個細胞，不計數重疊細胞。

1.2.3 FISH結果的判讀 分析200個細胞。1q21(CKS1B)基因擴增：紅色熒光標記CKS1B(1q21)探針，正常信號模式為2R(注：R為紅色信號)，陽性結果判斷閾值6.87%。t(4;14)易位形成的IGH/FGFR3融合基因：綠色熒光標記IGH(14q32)探針，紅色熒光標記FGFR3(4p16)探針，IGH/FGFR3融合基因顯示黃色或綠色與紅色疊加信號，正常信號模式為2G2R(注：G為綠色信號，R為紅色信號)，陽性結果判斷閾值6.47%。t(14;16)易位形成的IGH/MAF融合基因：綠色熒光標記IGH(14q32)探針，紅色熒光標記MAF(16q23)探針，IGH/MAF融合基因顯示黃色或綠色與紅色疊加信號，正常信號模式為2G2R(注：G為綠色信號，R為紅色信號)，陽性結果判斷閾值3.37%。t(14;20)易位形成的IGH/MAFB融合基因：綠色熒光標記IGH(14q32)探針，紅色熒光標記MAFB(20q12)探針，IGH/MAF融合基因顯示黃色或綠色與紅色疊加信號，正常信號模式為2G2R(注：G為綠色信號，R為紅色信號)，陽性結果判斷閾值1.32%。17p13.1(p53)基因缺失：紅色熒光標記p53(17p13.1)探針，正常信號模式為2R(注：R為紅色信號)，陽性結果判斷閾值6.09%(見圖1)。

圖1 FISH各探針正常圖像

1.2.4 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。組間計數資料之間比較應用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FISH檢測結果 110例以硼替佐米為基礎誘導化療的NDMM中，77例骨髓細胞進行了CD38磁珠分選后1q21、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)、17p-的FISH檢測。77例患者中陰性29例，1項異常34例，2項異常13例，3項異常1例。1q21陽性39例，其中7例合并t(4;14)陽性，4例合并17p-陽性，2例合并t(14;16)陽性，1例合并t(4;14)和17p-陽性，單純1q21陽性25例；1q21陰性38例，其中4例t(4;14)陽性，5例17p-陽性，單純1q21陰性29例；t(4;14)陽性12例，t(4;14)陰性65例；t(14;16)陽性2例，t(14;16)陰性75例；17p-陽性10例，17p-陰性67例；77例均t(14;20)陰性。見表1。

表1 FISH檢測結果[例(%)]

2.2 FISH異常各亞組以硼替佐米為基礎誘導化療的療效 FISH檢測陰性組共29例(38%),其中(0 FISH組)CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.9%；FISH檢測1項異常組(1 FISH組)共34例(44%)，其中CR 5例，VGPR 19例，PR 7例，MR 1例，SD 1例，PD 1例，ORR 91.2%；FISH檢測2項及以上異常組(2FISH組)共14例(18%)，其中CR 4例，VGPR 7例，PR 1例，MR 1例，SD 1例，ORR 85.7%。三組ORR兩兩對比，差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 FISH異常各亞組的療效

2.3 各不良預后FISH異常組以硼替佐米為基礎誘導化療的療效 25例單純1q21陽性的患者中，CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 1例，PD 1例，ORR 88%；29例單純1q21陰性的患者中，CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.8%。兩組ORR比較，差異無統計學意義(P=0.25)。見圖3。

圖3 1q21陽性與1q21陰性組的療效的比較

12例t(4;14)陽性的患者中，8例合并1q21擴增，其中1例合并17p-。12例患者中CR 4例，VGPR 8例，ORR 100%，但2例患者分別在3個月、6個月疾病進展，且1例患者發生髓外浸潤(死亡)；65例t(4;14)陰性的患者中，31例1q21擴增，其中4例合并17p-，2例合并t(14;16)，另34例患者中17p- 5例；29例單純t(4;14)陰性的患者中，CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.8%。t(4;14)陽性與陰性組的ORR比較差異無統計學意義(P=0.062)。見圖4。

圖4 t(4;14)陽性與t(4;14)陰性組療效比較

10例17p-陽性的患者中，5例合并1q21擴增，其中1例合并t(4;14)，10例患者中CR 1例，VGPR 6例，PR 1例，MR 1例，SD 1例，ORR 80%，但1例患者在16個月疾病進展；67例17p-陰性的患者中，34例1q21擴增，其中7例合并t(4;14)，2例合并t(14;16)，另33例患者，4例t(4;14)，29例單純17p-陰性(CR 5例，VGPR 11例，PR 6例，MR 1例，SD 6例，ORR 75.8%)，兩組ORR比較差異無統計學意義(P=0.58)。見圖5。

圖5 17p-陽性與17p-陰性組的療效的比較

本組77例行FISH檢測的患者中僅有2例t(14;16)，因陽性患者較少，陽性組與陰性組之間療效未能進行比較。

3 討論

多發性骨髓瘤作為一種高度異質性的克隆性漿細胞腫瘤，其總體生存期2～10年。高異質性除與白蛋白、β2微球蛋白、乳酸脫氫酶相關外，更重要的是細胞遺傳學的異常。由于骨髓瘤細胞的低增殖特性，傳統的細胞遺傳學檢測漏掉了很多細胞遺傳學異常，因此，間期FISH(iFISH)是首選方法，可檢測大于60%的遺傳變化[2]。本組77例NDMM做了高危細胞遺傳學[17p-、t(4;14)、t(14;16)、t(14;20)]及1q21的檢測，結果陽性率為62.3%，高危細胞遺傳學異常的陽性率為29.9%，與文獻報道的陽性率大致相符[2-3]。

MM患者的總體生存期很大程度上取決于腫瘤細胞的細胞遺傳學改變，因此，2015年開始在ISS分期的基礎上增加高危細胞遺傳學參數，即目前我們廣泛采用的ISS-R臨床分期[4]。從MM長遠的生存期看，尤其是17p-患者，目前尚無藥物克服這一遺傳學的改變，使得這一高危遺傳學改變的患者總體生存期明顯縮短。在本研究的77例患者中，0 FISH組、1 FISH組、2 FISH組的陽性率分別為38%、44%、18%。0 FISH組與Grzasko等[5]報道的37.3%相似，1 FISH組大于其報道的29.8%，2 FISH組小于報道的32.9%。本研究中，3組CR率分別為17.2%、14.7%、28.7%，CR+VGPR率分別為55.1%、70.6%、78.7%，結果表明，FISH檢測異常數目增加，但緩解率并沒有下降(不除外各組患者應用除硼替佐米之外的其他藥物所致的高緩解率)。

近年對于17p-、t(4;14)數據研究較多，而t(14;16)在骨髓瘤中發生率較低,約3%～5%[6-7]。Avet-Loiseau等[6]回顧性分析1 003例新診斷的多發性骨髓瘤患者t(14;16)，發現染色體易位發生率較低，僅為3.2%(32例)。進一步按照細胞遺傳學的改變，我們對1q21、t(4:14)及17p-進行了緩解率的比較。

IMWG 1q21擴增尚不屬于高危細胞遺傳學[8]，大多數研究證明其具有不良預后意義，其存在與較短的PFS和OS有關[9]。1q21的擴增對預后的影響主要與擴增的拷貝數相關，擴增拷貝數>3對生存的負影響已成為定論[10]。本組77例患者中1q21陽性39例，但15例患者合并了其他高危的細胞遺傳學改變，38例1q21陰性的患者中，9例合并了其他高危的細胞遺傳學改變，為避免其他細胞遺傳學的影響，我們對單純1q21陽性和陰性患者的緩解率進行了比較，兩組CR率分別為20%、17.2%，CR+VGPR分別為64%、55.1%，可見1q21的擴增并沒有影響以硼替佐米為基礎誘導化療的療效。同樣Chen等[11]研究中，1q21陽性硼替佐米組與非硼替佐米CR率分別為52.94%、10%(P=0.019)，可見硼替佐米可改善1q21陽性緩解率的負面影響。

由于硼替佐米的一線應用，t(4;14)異常這一高危細胞遺傳學改變已逐漸被向中危劃分[12]。本研究中，77例患者的t(4;14)陽性率為15.9%，CR率33.3%，VGPR率66.7%，與Grzasko等[5]報道的t(4;14)陽性率為16.3%相似。29例單純t(4;14)陰性的患者中，CR率17.2%，VGPR率37.9%，與 Mateos等[13]結論相似(VMP/VTP誘導化療后包括17p-在內的高危組CR率24%，標危組25%),表明t(4;14)不影響硼替佐米的緩解率。

盡管MM新的治療藥物不斷涌現[14]，目前仍沒有藥物能夠克服17p-的不良預后，17p-仍然是MM最高危的細胞遺傳學改變，短期內硼替佐米誘導可改善t(4;14)患者的預后，但不能改善del(17p)患者的預后[12]。本研究中的77例NDMM患者，17p-的陽性率12.9%，CR率10%，VGPR率60%，ORR 80%。與Cohen等[15]回顧性研究中，應用硼替佐米誘導治療17p-總緩解率為85%一致。17p-陰性29例患者中，CR率17.2%，VGPR率37.9%，與Liu等[16]報道一致，17p-陽性和陰性患者短期緩解率差異不顯著，表明17p-陽性不影響硼替佐米的緩解率。

4 結論

NDMM細胞遺傳學改變很大程度上影響患者的總生存期，但從短期療效看，即使存在高危細胞遺傳學改變，也不影響硼替佐米的緩解率。因此，硼替佐米仍然是NDMM患者的首選用藥。