小檗堿對奧氮平誘導胰島素抵抗大鼠炎癥因子及TLR4/NF-κB炎癥信號通路的影響

蘭建萍，劉守青，謝欣娥，王 俊

0 引言

奧氮平(Olanzapine，OLA)是臨床抗精神分裂癥的首選藥物之一[1]，但是易引起代謝紊亂，如體重增加、葡萄糖耐受不良、胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)等[2]。IR發生或加重與胰島素受體底物信號的損害有關[3]。Toll樣受體-4(Toll-like receptors-4，TLR-4)是模式識別受體家族的一員，其通過激活炎癥通路(如激活核因子κB，Nuclear factor kappa B，NF-κB)來調節免疫反應[4]。因此,抑制胰島素靶組織(肌肉、肝臟和脂肪組織)中TLR-4/NF-κB信號通路有望成為預防長期服用奧氮平引起代謝紊亂的新靶點[5]。小檗堿(Berberine，BBR)是一種常見的異喹啉類生物堿，可被用于治療一些慢性代謝紊亂性疾病，并且在多種疾病模型中，TLR-4/NF-κB通路被證實是BBR發揮生理學作用的重要機制之一[6-8]。故本文旨在基于TLR-4/NF-κB通路，探討BBR對OLA誘導的胰島素抵抗的改善作用。

1 對象與方法

1.1 實驗動物 36只6周齡SPF級的雄性SD大鼠(220±10)g購于湖南省中醫藥研究院實驗室，許可證號：SCXK(湘)2016-0002。將動物飼養在浙江省中醫藥大學實驗動物房內，實驗動物許可證號：SYXK(浙)2019-0024。所有操作均符合動物倫理學要求。飼養環境：(22±2)℃，12 h光/暗交替，單籠飼養。

1.2 主要儀器與試劑 ABI 7500 型Real-time PCR儀購自美國Thermofisher公司；One Touch Ultra穩豪系列血糖儀購自美國LifeScan Inc公司，試紙批號287695。奧氮平(貨號：LRAA9505，含量>99%)，小檗堿(貨號：67K1454)購自美國Sigma公司；胰島素(E-EL-R2466c)、腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)(E-EL-R0019c)、白細胞介素-1β(Interleukin 1beta，IL-1β)(E-EL-R0012c)及IL-6(E-EL-R0015c)ELISA試劑盒均購自武漢伊萊瑞特公司。初級單克隆抗體包括TLR4、p-NF-κB p65、NF-κB p65、NF-κB抑制蛋白(NF-κB inhibitor α，IκBα)、p-IκBα及β-actin和二級抗體均購自于賽信通(上海)生物試劑有限公司；

1.3 實驗分組及處理 在實驗開始前，動物在實驗室條件下適應飼養1周。稱量大鼠體重，按照隨機數字表法分為對照組、OLA組和OLA+BBR組，每組各12只。OLA組大鼠每日腹腔注射OLA 8 mg/kg，OLA+BBR組大鼠給予OLA(腹腔注射)8 mg/kg+BBR(灌胃)200 mg/kg，對照組大鼠腹腔注射等量的無菌生理鹽水，連續給藥8周。應用穩態模型法(HOMA model)計算胰島素抵抗指數(Homeostasis model assessment insulin resistance，HOMA-IR)，OLA組HOMA-IR與對照組有統計學差異表明建模成功。

1.4 觀察指標及檢測方法

1.4.1 空腹血糖、體重及IR指數測定 常規記錄大鼠體重。最后1次給藥結束后，禁食14 h，從尾尖切口采集血液標本約0.5 ml，置于EP管中抗凝后，3 500 r/min離心20 min(半徑22 cm)。用血糖儀測定空腹血糖(Fasting blood glucose，FBG)水平。并采用胰島素ELISA試劑盒測定各組大鼠血清空腹胰島素(Fasting insulin，Fins)水平，計算HOMA-IR。HOMA-IR = FBG (mmol/L) ×Fins(μg/L) /22.5。

1.4.2 組織樣本獲取 最后1次采血結束后，取大鼠肝臟和附睪白色脂肪組織(Epididymal white adipose tissues，eWAT)切開分成2部分：一半用液氮凍存后保存在-80 ℃下，直至用于Western blot分析；另一半用4%多聚甲醛在0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)中浸泡固定。石蠟包埋，進行HE染色。

1.4.3 ELISA法檢測血清和組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平 取肝臟和eWAT組織，經液氮碾磨，用RIPA裂解液提取組織中的蛋白。收集大鼠血清，采用BCA試劑盒對樣本蛋白進行定量，ELISA法檢測血清和組織中TNF-α、IL-1β及IL-6水平。

1.4.4 Western blot法檢測肝臟和eWAT組織相關蛋白 取肝臟和eWAT組織蛋白。經BCA定量后，采用Western blot技術，電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。按抗體說明書進行配比，分別用TLR4抗體(1∶200)、p-NF-κB p65抗體(1∶500)、NF-κB p65抗體(1∶250)、IκBα抗體(1∶500)、p-IκBα抗體(1∶500)4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10 min。加入帶HRP標記的二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。曝光儀曝光。

1.4.5 病理組織分析 利用標準方案對肝臟和eWATs進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色，并進行石蠟包埋。將組織切片(4 μm)在光學顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 BBR對OLA誘導的IR大鼠模型體重、血糖和IR的影響 實驗過程中未出現動物死亡。實驗結束時，OLA組大鼠體重、血清FBG、Fins和HOMA-IR均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而OLA+BBR組大鼠血清FBG、Fins和HOMA-IR低于OLA組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 實驗結束時各組大鼠FBG、Fins、IR比較

2.2 BBR對OLA誘導的IR大鼠模型血清和組織中炎癥因子水平的影響 實驗結束時，OLA組大鼠血清和eWAT組織中TNF-α、IL-1β、IL-6均高于對照組(P<0.05)；而OLA+BBR組大鼠血清和eWAT組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于OLA組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 實驗結束時各組大鼠血清和組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較注：與對照組相比，*P<0.05；與OLA組相比，#P<0.05

2.3 BBR對OLA誘導的IR大鼠肝臟和eWAT組織病理改變的影響 顯微鏡下顯示，與對照組大鼠相比，OLA組以彌漫性肝大泡性脂肪變性為主要特征，胞漿內可見大小不等的圓形空泡，脂肪細胞體積增大且形態大小不一，并且可見部分泡沫細胞浸潤，中性粒細胞浸潤數量增多。而OLA+BBR組肝臟和eWAT組織上述病理學改變較OLA組減輕，且中性粒細胞數量減少，未見明顯纖維化改變，見圖2。

圖2 各組大鼠肝臟和eWAT組織HE染色(100×)注：黃色箭頭表示胞漿內出現大小不等的圓形空泡

2.4 BBR對OLA誘導的IR大鼠肝臟組織和eWAT組織中TLR4/NF-kB炎癥信號通路相關蛋白表達的影響 經Western blot法檢測，OLA組肝臟組織和eWAT組織中TLR4/β-actin、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα蛋白表達比值均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)；而OLA+BBR組肝臟組織和eWAT組織中TLR4/β-actin、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-IκBα/IκBα蛋白表達比值均低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3。

圖3 Western blot法檢測各組蛋白表達注：與對照組相比，*P<0.05；與OLA組相比，#P<0.05

3 討論

長期服用非典型抗精神病藥物OLA所致胰島素抵抗可能導致藥物不依從，增加胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的風險等，是目前臨床上亟待解決的重要問題[9]。BBR是在黃連、黃柏等藥材中含量較高的異喹啉生物堿，能夠顯著抑制高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型體重增加和血糖血脂及炎癥因子水平升高，同時上調脂聯素濃度、下調瘦素水平、改善胰島素抵抗等[10]。黃平等[11]通過納入105例OLA致體重增加的精神分裂癥患者作為研究對象，證實黃連與肉桂配伍可改善長期服用奧氮平引起的糖脂代謝紊亂；此外，劉守青等[12]則利用長期服用OLA構建的大鼠胰島素抵抗模型證實，黃連聯合枸杞子可顯著降低胰島素抵抗相關蛋白脂肪酸轉運酶、蛋白質酪氨酸磷酸酶-1B、香葉基香葉基焦磷酸合成酶、G蛋白偶聯受體激酶2、三酰甘油脂肪酶的表達水平，進而改善大鼠的胰島素抵抗，為臨床預防或降低OLA不良反應提供了一定的參考依據。但是目前很少有學者討論BBR單獨用藥對OLA誘導的胰島素抵抗大鼠模型的影響。本文結果初步證實，BBR通過抑制輕度炎癥反應進而明顯減輕OLA誘導的胰島素抵抗，其機制之一可能與阻止TLR-4/NF-κB炎癥信號通路的激活有關。

BBR具有多種生物活性，例如通過抑制 TLR-4/NF-κB通路[13-15]，減輕鏈脲佐菌素誘導的大鼠腎損傷、炎癥反應以及高糖誘導的足細胞凋亡[16]；改變肥胖大鼠模型腸道微生物組成并增加肝糖原合成量，進而降低FBG、三酰甘油、低密度脂蛋白膽固醇和胰島素抵抗等[7，17]。此外Zhao等[18]發現，BBR還可抑制LPS誘導的TLR-4/NF-κB炎癥信號通路激活，導致胰島素受體和胰島素受體底物-1在肝臟中的表達增加，進而減輕非酒精性脂肪肝引起的肝臟脂肪變性，說明抑制TLR-4/NF-κB信號通路激活可能也是BBR改善胰島素抵抗的重要分子機制之一。在臨床實際中，OLA引起的體重增加可能導致藥物依從性差，并增加胰島素抵抗、糖尿病和心血管疾病的風險。本研究通過大鼠模型證實，連續灌胃8周，BBR(200 mg/kg)可顯著降低OLA誘導的IR大鼠模型血清FBG水平和HOMA-IR，并減緩大鼠體重增加速度，且對于肝臟組織和eWAT組織脂肪變性有一定的預防作用。

近年來，炎癥在多種因素介導的胰島素抵抗發病機制中的作用越來越受到重視[19-20]。促炎性細胞因子與胰島素抵抗的風險增加呈正相關性[21]。在本研究中，OLA可顯著增加血清、肝臟組織和eWAT組織中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，而OLA+BBR組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平則低于OLA組，說明BBR有一定的抗炎作用，這可能是其有助于抑制大鼠IR的重要原因。TLR-4是TLRs家族中的一員，它通過激活炎癥途徑來調節免疫反應[22]。與相關配體CD14、MD2等結合之后，通過IκB激酶(IκB kinase，IKK)-NF-κB復合物和絲裂原活化激酶(Mitogen activated kinase，MAPK)途徑促進下游信號傳遞，進而負性調節胰島素受體信號[23]。另外，García-Bueno等[24]在精神分裂癥患者體內發現TLR4促炎通路處于激活狀態。同時，長期使用OLA會進一步上調TLR-4表達[25]，隨著時間的推移，這種上調會削弱胰島素的作用，進而導致胰島素靶組織(肌肉、肝臟和脂肪組織等)和免疫細胞(單核細胞和巨噬細胞)中TLR-4表達增加和下游信號傳導增強，引起胰島素抵抗。因此，TLR-4/NF-κB炎癥信號通路可能是治療OLA誘導的胰島素抵抗的有效分子靶點[26-27]。本研究結果表明,BBR能有效抑制OLA導致的TLR4/NF-κB信號通路激活。這也與Zhu等[28]在糖尿病腎病大鼠模型中發現的小檗堿通過抑制TLR4/NF-κB途徑改善糖尿病腎病的結論相佐證。

總之，本研究首次應用BBR對OLA誘導的IR大鼠模型進行干預治療，取得了良好的藥效學結果，證實BBR可明顯減緩IR大鼠的體重增加速度和炎癥反應，可能有助于改善胰島素抵抗，其作用機制與抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路激活有關。但是本研究也存在一定的局限性，一方面該結論無法證實BBR與OLA是否存在藥物之間的相互作用；另一方面BBR對于OLA誘導的胰島素抵抗的改善作用是否還受到其他通路或機制的影響尚不得知，這將是本課題組下一步工作的研究重點。