擬水平均勻設計法優化超聲輻照微泡促人骨髓間充質干細胞分泌SDF-1的實驗研究

李 露 何 芬 楊鳳武 古 靜 徐亞麗

近年來，干細胞療法作為新型治療手段逐漸應用于多種疾病。其中，骨髓來源的間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）由于其取材較為容易、免疫原性較弱且具有分化為多種細胞的能力，成為研究的熱點之一［1］，其治療效果與移植入體內后到達靶組織的效率密切相關。基質細胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）是最重要的趨化與歸巢相關分子之一［2］，與其受體CXC趨化因子受體4一起作用，有助于MSCs向靶組織遷移歸巢［3］，而提高靶區SDF-1濃度可促進更多的MSCs歸巢。前期研究［4］表明，超聲輻照微泡可提高MSCs的移植效率及歸巢能力，其機制可能為微泡增強的超聲生物學效應可促使MSCs旁分泌SDF-1，使靶區組織SDF-1含量增高［5］。但關于超聲輻照微泡促MSCs分泌SDF-1的參數優化方面的研究較少。本研究采用擬水平均勻實驗設計法，選取超聲輻照強度、超聲輻照時間及微泡濃度3個實驗參數，各設5個水平以篩選影響MSCs分泌SDF-1的最優因素組合。

材料與方法

一、主要材料與儀器

人骨髓MSCs細胞株（美國Sciencell公司）；干細胞完全培養基（廣州賽業生物科技公司）；0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國Hyclone公司）；人SDF-1 ELISA試劑盒（美國R&D公司）；CCK-8溶液（北京碧云天生物技術公司）；造影劑“脂氟顯”（陸軍軍醫大學第二附屬醫院超聲科實驗室自制）為脂質膜包裹全氟丙烷氣體的微泡，粒徑2～10μm，其中98%小于8μm，微泡平均濃度約為（7～8）×109個/ml，使用前用生理鹽水稀釋至相應濃度；酶聯免疫分析儀（F039300，澳大利亞Tecan公司）；超聲治療儀（Accusonic Plus，澳大利亞Metro Medical公司），除輻照強度和輻照時間隨實驗調整外，超聲發射頻率固定為1 MHz，占空比設為10%。

二、主要實驗方法

1.細胞培養：將人骨髓MSCs細胞株用含10%胎牛血清的干細胞完全培養基在37℃、5%CO2孵箱中培養，每4～6天傳代1次。取對數生長期的細胞用0.25%EDTA-胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液后以每孔1×106的密度接種于六孔板中，每孔細胞懸液量約2 ml，放于孵箱靜置6～8 h，待細胞完全貼壁后即可用于不同影響因素條件下的超聲輻照。

2.實驗設計與分組：采用雙均數擬水平均勻實驗設計，選定超聲輻照強度、超聲輻照時間、微泡濃度3個常見影響因素，每因素設5個水平，分別為：①超聲輻照強度，即0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2；②超聲輻照時間，即0（對照）、20、30、40、60 s；③微泡濃度，即0（對照）、102、104、106、108個/ml。根據均勻設計表U15（155）安排的實驗分組進行超聲輻照，應用多元線性回歸及逐步回歸統計學方法分析，并綜合考慮各因素間的關系，以相對高的SDF-1分泌量（上清液中SDF-1濃度）和相對低的細胞死亡率（MSCs存活率）為目標，確定最優影響因素組合。然后分別按照超聲輻照時間、超聲輻照強度、微泡濃度3個因素進行驗證，具體：①考察超聲輻照強度，分為0（對照）、0.2、0.4、0.6、0.8 W/cm2，此時超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml；②考察超聲輻照時間，分為0（對照）、20、30、40、60 s，此時超聲輻照強度0.6 W/cm2，微泡濃度106個/ml；③考察微泡濃度，分為0（對照）、102、104、106、108個/ml，此時超聲輻照時間30 s，超聲輻照強度0.6 W/cm2。

3.ELISA法檢測SDF-1含量：將人骨髓MSCs經超聲輻照并繼續培養24 h后，分別吸取每孔上清液作為樣品。將不同濃度的SDF-1標準品和稀釋后的各個樣品加入酶標板內，按照人SDF-1 ELISA試劑盒說明書步驟依次操作，最后使用酶聯免疫分析儀測定樣品于450 nm光譜處的吸光度值，根據樣品的吸光度值和稀釋倍數檢測樣品濃度。

4.CCK-8法評估細胞活性：將人骨髓MSCs經超聲輻照并繼續培養24 h后，收集各組人骨髓MSCs制成單細胞懸液，以每孔2×103的密度接種于96孔板中，每孔100μl，將未被超聲輻照的人骨髓MSCs設為對照。將96孔板于孵箱靜置6～12 h待細胞全部貼壁后，每孔加入10μl CCK-8溶液。孵箱繼續放置2 h后，設僅含有100μl單純細胞培養基的孔為空白對照孔，采用酶聯免疫分析儀測量每個樣品孔于450 nm光譜處的吸光度值，細胞存活率（%）=樣品孔吸光度值/空白對照孔的吸光度值×100%。

三、統計學處理

應用SPSS 13.0統計軟件，參數篩選采用雙指標擬水平均勻設計，應用多元線性回歸分析及逐步回歸分析篩選最優影響因素組合。P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

一、優化SDF-1分泌的最優影響因素組合

通過雙指標擬水平均勻實驗設計優化超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的因素，按U15（155）均勻實驗設計表設計，見表1。

表1 超聲輻照參數篩選實驗擬水平均勻設計表及實驗結果

應用多元線性回歸分析，得到雙指標的回歸方程為：

兩個回歸方程對應的概率值P=0.003、0.014，均小于0.05，總回歸效果顯著。偏回歸效果檢驗顯示，因素B（微泡濃度）對SDF-1分泌量的偏回歸貢獻不顯著（P＜0.05），說明其對SDF-1分泌量的作用可由其他因素代替，故需進一步行逐步回歸分析，得逐步回歸方程為：

方程對應的概率值P＜0.05，總回歸效果顯著。采用方程（2）、（3）對實驗影響因素進行優化，并綜合考慮各因素間關系后，最終確定最優影響因素組合為超聲輻照強度0.6 W/cm2，超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml。

二、不同參數條件下SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細胞存活率結果

1.超聲輻照后即刻，光鏡下可見貼壁的人骨髓MSCs胞質回縮，細胞折光率增強，超聲輻照強度加大時部分細胞甚至漂浮起來。放于孵箱靜置培養24 h后，絕大部分人骨髓MSCs會重新貼壁生長，形態與正常細胞相比無明顯差別。見圖1。隨著超聲輻照強度增加，存活下來貼壁生長的人骨髓MSCs越來越少。

圖1 人骨髓MSCs在微泡濃度106個/ml、超聲輻照時間30 s即刻及輻照后24 h不同超聲輻照強度下的光鏡圖（×100）

2.對優化篩選后的影響因素進行驗證，超聲輻照強度、微泡濃度和超聲輻照時間3個因素對SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細胞存活率的影響見圖2。圖2A顯示，隨著超聲輻照強度的增強，SDF-1濃度逐漸增大，輻照強度為0.6 W/cm2時，SDF-1濃度達到峰值（551.67±40.88）ρg/ml，當輻照強度繼續增大至0.8 W/cm2，SDF-1濃度反而下降；同時，細胞存活率隨著超聲輻照強度的增加顯著降低，輻照強度為0.6 W/cm2時，細胞存活率為（88.51±4.03）%，輻照強度繼續增加至0.8 W/cm2時，細胞存活率下降至（71.02±7.97）%。圖2B顯示，SDF-1濃度隨超聲輻照時間增加而增加，超聲輻照強度為0.6 W/cm2時SDF-1濃度達到峰值，超聲輻照時間＞30 s時，SDF-1濃度即開始下降，輻照時間為60 s時，SDF-1濃度降至（492.47±19.64）ρg/ml；另外，超聲輻照時間越長，細胞存活率越低，輻照時間為60 s時降至（65.67±6.04）%。圖2C顯示，隨著微泡濃度的增大，SDF-1濃度也逐漸增大，于微泡濃度為106個/ml時達到峰值，當微泡濃度增大至108個/ml，SDF-1濃度下降至（468.16±49.91）ρg/ml，同時細胞存活率也顯著下降至（62.26±7.27）%。結果顯示，當超聲輻照強度為0.6 W/cm2、超聲輻照時間為30 s、微泡濃度為106個/ml時，SDF-1分泌量和人骨髓MSCs細胞存活率可達到相對匹配的數值。

圖2 不同影響因素條件下超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1和細胞存活情況

討論

在醫院臨床和基礎研究中經常接觸到包含多因素、多水平雙指標的實驗，如交叉匹配各個因素和水平進行全面實驗，不僅要花費大量的人力、物力，還需相當長的時間，顯然是不實際的。正交設計法和均勻設計法均能在不影響實驗效果的前提下，盡可能減少實驗次數，前者的實驗次數是后者實驗次數的整數倍，故均勻設計法是一種更加高效、快速、經濟的實驗設計方法。本研究采用擬水平均勻設計超聲輻照微泡后人骨髓MSCs SDF-1分泌量和MSCs細胞存活率的雙指標實驗，旨在探討超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的最優條件。

方程（2）中，因素A（超聲輻照強度）、B（微泡濃度）、C（超聲輻照時間）系數均為負值，具有阻礙細胞存活的作用，說明取低值有利于細胞存活，適宜范圍內應取下限值；方程（3）中，因素A、C系數均為正值，具有促進SDF-1分泌的作用，說明高值有利于SDF-1分泌，適宜范圍內應取上限值，因素B不包含于方程（3）中，說明不同的因素B取值對SDF-1分泌無明顯的影響作用，可作為常量。綜合分析，因素A對促SDF-1分泌與細胞存活率有相反作用的影響，且對促SDF-1分泌的影響更大，故取較中間值大一點的數值，即0.6 W/cm2；因素C對促SDF-1分泌與細胞存活率也有相反作用的影響且影響力類似，故取中間值30 s；因素B對促SDF-1分泌無影響，對細胞存活率有影響，宜取低值，但由于方程（2）中因素B的系數為-1.791E-7，B的取值范圍為0～106個/ml，實際上對細胞存活的影響均微小，僅當因素B的取值達到108個/ml時，對細胞存活率才有顯著的阻礙作用，考慮到實際操作的準確性（微泡濃度越低操作誤差越大），因素B取106個/ml。所以，根據方程（2）、（3），綜合考慮促SDF-1分泌量和高的細胞存活率的最優影響因素組合為：超聲輻照強度0.6 W/cm2，微泡濃度106個/ml，超聲輻照時間30 s。

研究［6-7］表明，超聲輻照微泡雖可促使人骨髓MSCs分泌SDF-1，但隨著超聲輻照強度、輻照時間的增加，其輻照能量也不斷增強，超過一定閾值后，細胞就會溶解和死亡。超聲微泡造影劑注入體內后，作為空化核可以大大降低超聲生物學效應（主要是空化效應）的閾值，使空化效應強度顯著增加。在離體實驗［8］中，當細胞周圍存在大量空化核（如微泡造影劑）時，微泡增強的超聲空化效應也可對被輻照細胞造成不可逆的損傷。所以，需要找到超聲輻照時間、輻照強度和微泡數量/濃度的最優組合，希望在保證較多的MSCs存活的前提下，超聲輻照微泡能有效促進其分泌更多的SDF-1。本研究結果提示，超聲輻照強度、超聲輻照時間或微泡濃度超過一定閾值后，大量的人骨髓MSCs會因輻照能量過高或空化核濃度過大而死亡，導致相應的SDF-1分泌量也減少。本研究采用均勻設計法和回歸分析的統計學方法篩選出體外超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1的最優影響因素組合，即超聲輻照強度0.6 W/cm2，超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml。使用該最優組合時人骨髓MSCs的存活率為（88.51±4.03）%，同時SDF-1分泌量顯著增加，達（551.67±40.88）ρg/ml。當然，超聲輻照微泡作用于動物或人體時，涉及的相關超聲作用因素更多，優化篩選過程也會更加復雜，需后續實驗研究的進一步探討。

綜上所述，采用擬水平均勻設計法篩選出超聲輻照微泡促人骨髓MSCs分泌SDF-1和細胞存活率達到相對匹配的最優影響因素組合為：超聲輻照強度0.6 W/cm2，超聲輻照時間30 s，微泡濃度106個/ml。