膽道閉鎖無創(chuàng)診斷現(xiàn)狀與研究進(jìn)展

程 珍 綜述 吳宙光 葉泳欽 審校

膽道閉鎖（biliary atresia，BA）是新生兒梗阻性黃疸的常見病因，其主要病理特征為肝內(nèi)外膽管進(jìn)行性炎癥和肝纖維化。BA的病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，如不及時(shí)治療，患者多在2歲內(nèi)死于肝硬化、肝衰竭。1959年，日本學(xué)者M(jìn)orio Kasai創(chuàng)立了肝門空腸吻合術(shù)（Kasai手術(shù)），該術(shù)式為目前治療BA的首選手術(shù)方式，可延緩肝臟纖維化進(jìn)程，提高自體肝存活率。而早期Kasai手術(shù)是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素，因此早期診斷BA是臨床上極為迫切的工作。目前，術(shù)中膽道造影及肝組織活檢是公認(rèn)的BA診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但二者屬于有創(chuàng)診斷方法［1］。美國(guó)兒科學(xué)會(huì)建議開展更多研究以制定規(guī)范的策略，從而盡早發(fā)現(xiàn)BA［2］。近年來小兒外科領(lǐng)域致力于探尋行之有效，且靈敏度、特異度高的無創(chuàng)早期診斷模式。現(xiàn)圍繞大便比色卡，糞便、尿液、血液來源的標(biāo)記物及影像學(xué)檢查等無創(chuàng)診斷方法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、早期篩查

（一）大便比色卡

大便比色卡（stool color card，SCC）是一種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的早期無創(chuàng)篩查方法，可于患者出生時(shí)將SCC附于母嬰健康手冊(cè)上。BA患者的大便多為白陶土樣便，父母可依據(jù)SCC對(duì)嬰兒大便顏色進(jìn)行比對(duì)，早期篩查出黃疸不明顯的BA及其他嬰兒膽汁淤積性疾病。該方法最早由日本的Matsui和IshiKawa發(fā)起并實(shí)施［3］。其后，中國(guó)臺(tái)灣于2004年推出更為全面與普及的SCC早期篩查BA方案，該方案診斷BA的靈敏度、特異度分別為89.7%和99.9%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為28.6%和99.9%［4］。目前SCC在美國(guó)、日本、加拿大等國(guó)家均取得較為滿意的篩查效果。在中國(guó)大陸地區(qū)，Zheng等［5］對(duì)深圳地區(qū)的研究結(jié)果顯示：通過實(shí)施該篩查方案，BA診斷年齡從（80±12）天降至（56±15）天。近年來信息化、大數(shù)據(jù)及人工智能的進(jìn)一步發(fā)展，SCC由最初的圖片人工識(shí)別發(fā)展到數(shù)字圖像分析，再發(fā)展至通過智能手機(jī)應(yīng)用程序比對(duì)，其進(jìn)步有助于家長(zhǎng)對(duì)患者大便進(jìn)行監(jiān)測(cè)，使SCC篩查更易于廣泛開展［6，7］。也有研究表明，SCC可降低BA患者Kasai手術(shù)日齡，提高自體肝生存率，從而改善預(yù)后［5，8］。

（二）糞便來源標(biāo)記物

腸道菌群的相關(guān)研究是目前各學(xué)科的研究熱點(diǎn)。腸桿菌科（enterobacteriaceae）是一種促炎、有潛在致病性的分類單元，膽汁酸是調(diào)節(jié)腸道菌群的主要因子［9］。BA患者因膽道梗阻，導(dǎo)致膽鹽及膽汁酸無法排泄于腸道，可致腸道菌群紊亂。腸桿菌科的豐度在肝硬化患者糞膽汁酸水平下降時(shí)較高，而正常健康人腸道的菌群以雙歧桿菌、乳桿菌居多［10］。Wang等［11］研究發(fā)現(xiàn)BA患者腸道菌群的豐度和結(jié)構(gòu)有顯著改變；在微生物門水平，BA患者變形菌門豐度升高，而擬桿菌門豐度降低。在屬水平，BA患者體內(nèi)多種潛在的致病菌如鏈球菌、克雷伯桿菌大量增殖，而產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌、雙歧桿菌數(shù)量減少，因而鏈球菌與擬桿菌豐度比這一指標(biāo)診斷BA效能較高（曲線下面積＝0.96，P＜0.001）。但目前腸道菌群的紊亂情況尚缺乏大數(shù)據(jù)支持，收集糞便樣本，研究腸道菌群與BA免疫機(jī)制之間的關(guān)聯(lián)性，有望通過腸道菌群的改變?cè)缙谧R(shí)別BA，為改善BA患者預(yù)后提供一定理論依據(jù)。

（三）尿液來源標(biāo)記物

膽汁酸通常以與牛磺酸或甘氨酸相結(jié)合的形式，通過尿液排出體外，尿液中硫酸化膽汁酸（urine sour bile acid，USBA）的水平是判斷兒童膽汁淤積程度的高度敏感指標(biāo)。Shinka等［12］采用質(zhì)譜分析方法將BA患者與膽汁淤積癥患者的尿液進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BA患者尿液中硫酸化牛磺膽酸水平顯著增高，認(rèn)為測(cè)定硫酸化牛磺膽酸可能是篩查新生兒BA的一種有效方法。此外，當(dāng)尿膽素原水平在0.32 mg／dL以下時(shí)，可以區(qū)分BA與其他非BA導(dǎo)致的膽汁淤積癥，其靈敏度、特異度分別為88%、73%；且當(dāng)該臨界值與GGT相結(jié)合鑒別BA與其他膽汁淤積性疾病時(shí)，靈敏度、特異度分別為80%、100%，表明兩種指標(biāo)結(jié)合時(shí)診斷的準(zhǔn)確性有所提高，此方法值得在發(fā)展中國(guó)家推廣［13］。而后Suzuki等［14］通過酶學(xué)分析法對(duì)大樣本尿液標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)USBA高于55.0μmol／g時(shí)，需與其他膽汁淤積癥患者進(jìn)行鑒別。USBA試驗(yàn)可區(qū)分母乳喂養(yǎng)與其他肝臟疾病引起的持續(xù)性黃疸。Li等［15］采用氣相色譜－質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GCMS）對(duì)101名受試者的尿液樣本進(jìn)行非靶向代謝組學(xué)分析，鑒定出41種明顯改變的代謝物，其結(jié)果表明在不同的肝臟疾病中，尿液的成分會(huì)發(fā)生變化，個(gè)別尿液代謝物如N-乙酰-d-甘氨酸（N-acetyl-Dmannosamine，ManNAc）和α-氨基己二酸（alpha-aminoadipic acid，α-AAA）在區(qū)別BA患者和嬰兒肝炎綜合征（infantile hepatitis syndrome，HIS）方面具有較高的靈敏度和特異度，可作為鑒別診斷BA和兒童肝炎綜合征的潛在生物標(biāo)志物。采用水溶性尿硫酸膽汁酸直接酶法測(cè)定尿液中USBA水平具有簡(jiǎn)單、無創(chuàng)、廉價(jià)、敏感的優(yōu)勢(shì)，但其代謝物的改變僅用于鑒別BA與其他原因引起的膽道疾病，不能對(duì)BA進(jìn)行早期精確診斷。

（四）血液來源標(biāo)記物

1.膽紅素：膽紅素檢測(cè)方便快捷，是目前肝功能指標(biāo)中較常用于早期篩查BA的血液生化指標(biāo)。Powell等［16］于2003年率先報(bào)道通過測(cè)定新生兒血液中結(jié)合膽紅素水平早期篩查BA，該研究發(fā)現(xiàn)在血清膽紅素水平升高（≥300 mg／mL）的情況下，當(dāng)直接膽紅素升高占總膽紅素的15%時(shí)，應(yīng)排除嬰兒膽汁淤積性疾病；而當(dāng)直接膽紅素水平占總膽紅素的50%以上時(shí)，應(yīng)高度懷疑BA［17］。近年來，Harpavat等［18］采用兩步策略對(duì)BA篩查效果進(jìn)行評(píng)估：在南德克薩斯出生的124 385名嬰兒中，有123 279名（99%）在出生后60 h內(nèi)接受了結(jié)合膽紅素或直接膽紅素檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法的靈敏度為100%（95%CI：56%～100%），特異度為99.9%（95%CI：99.9%～99.9%），陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為5.9%（95%CI：2.6%～12.2%）。膽紅素的測(cè)定簡(jiǎn)單易行，直接膽紅素水平有助于BA患者的早期診斷，目前也常作為術(shù)后隨訪的重要指標(biāo)之一［18］。然而，膽紅素升高作為一種早期識(shí)別手段，其陽(yáng)性預(yù)測(cè)值較低，臨床上仍需結(jié)合膽道造影來明確診斷。

2.谷氨酰轉(zhuǎn)移酶：谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（gammaglutamyl transpeptidase，GGT）是評(píng)估膽管系統(tǒng)損傷程度的敏感指標(biāo)，GGT增高常提示膽管梗阻。GGT活性檢測(cè)廣泛應(yīng)用于BA的輔助診斷。據(jù)報(bào)道，不同截?cái)嗨紾GT診斷BA的準(zhǔn)確性各不相同，當(dāng)GGT＞300 U／L或每日增加6 U／L可用于區(qū)分BA和其他新生兒膽汁淤積癥，準(zhǔn)確率分別為85%和88%［19］。當(dāng)臨界值為286 U／L時(shí)，GGT鑒別BA的靈敏度及特異度分別為76.7%和80%［20］。此外，GGT對(duì)BA診斷的參考范圍與年齡密切相關(guān)，Rendon-Macias等［21］通過研究不同年齡段GGT對(duì)BA的診斷效能，在加入年齡相關(guān)的影響因素后，可提高GGT診斷BA的準(zhǔn)確性。Chen等［19］對(duì)1 649例患者進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)BA組患者術(shù)前總膽紅素、直接膽紅素和GGT水平顯著升高（P＜0.05），而非BA組堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平較高（P＝0.0003），TB、DB、GGT和ALP的ROC曲線下面積分別為0.584、0.614、0.843和0.398；將不同年齡患者進(jìn)行分組，分別測(cè)定GGT的水平和診斷效能時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于日齡120天以內(nèi)的患者，GGT水平有利于BA的診斷；因此，年齡是GGT診斷BA的重要考量因素，這與Rendon-Macias等［21］得到的結(jié)論一致。Li等［15］采用Logistic回歸分析鑒別BA和新生兒肝炎綜合征患者的臨床指標(biāo)和兩組之間的代謝物差異，GGT和ALP的曲線下面積分別為0.876和0.822。這與Russo［22］前期研究結(jié)果一致。此外，Dong等［23］回顧性分析了1 728例新生兒梗阻性黃疸的資料，其中包括1 512例BA患者，發(fā)現(xiàn)GGT和BA相關(guān)的其他危險(xiǎn)因素（包括體重、性別、DB和ALP）聯(lián)合進(jìn)行診斷時(shí)，診斷效能顯著提高。綜上所述，GGT作為一種診斷價(jià)值較高的無創(chuàng)檢測(cè)標(biāo)志物，應(yīng)結(jié)合其截?cái)嗨健⒛挲g等因素，以提高診斷BA的準(zhǔn)確率。GGT與其他生物標(biāo)志物（如MMP-7）聯(lián)合應(yīng)用可提高診斷的準(zhǔn)確性［24，25］。

（五）血清來源標(biāo)記物

1.基質(zhì)金屬蛋白酶-7（matrix metalloproteinase-7，MMP-7） MMP-7是一種通過細(xì)胞外基質(zhì)分解參與細(xì)胞間信號(hào)傳遞的蛋白酶，肝細(xì)胞中主要由膽管上皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生MMP-7［26］。其水平的變化主要反映肝臟纖維化程度，可用于BA的早期診斷。Jiang等［26］研究發(fā)現(xiàn)BA患者血清MMP-7水平明顯高于有膽汁淤積的非BA患者，選擇MMP-7水平52.85 ng／mL作為臨界點(diǎn)時(shí)，可將BA與其他引起膽汁淤積的疾病加以區(qū)分，其靈敏度為95.19%，特異度為93.07%，陰性預(yù)測(cè)值為91.43%。同時(shí)，有多項(xiàng)研究表明，MMP-7與膽汁淤積的標(biāo)記物谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）聯(lián)合使用時(shí)，診斷準(zhǔn)確率可達(dá)95%，大大提高了早期診斷的準(zhǔn)確性［24，25］。血清MMP-7（單獨(dú)或聯(lián)合GGT）可作為BA早期無創(chuàng)診斷的生物標(biāo)志物，同時(shí)MMP-7可用于預(yù)測(cè)BA的預(yù)后，并可能成為治療BA的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)已有醫(yī)療中心通過檢測(cè)血清MMP-7水平進(jìn)行BA的診斷，但該方法能否代替術(shù)中膽道造影，尚需更大樣本量及更多的臨床試驗(yàn)來驗(yàn)證。此外，其他MMPs在BA患者血清中也有一定升高，例如MMP-2、MMP-3、MMP-9等，但其升高程度及診斷價(jià)值遠(yuǎn)不如MMP-7［27，28］。

2.RNAs：MicroRNAs是近來研究BA發(fā)病機(jī)制的“明星分子”，其在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起作用，BA患者血清中可能含有高靈敏度和高特異度的miRNA生物標(biāo)志物。Zahm等［29］將BA與其他形式的新生兒高膽紅素血癥患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)miR-200a、miR-200b、miR-429在BA患者中的表達(dá)皆上調(diào)，具有一定的診斷價(jià)值。另一方面，在另一項(xiàng)具有潛在診斷價(jià)值的研究中也報(bào)道了miR-4429的下調(diào)和miR-4689的上調(diào)［30］。此外，Peng等［31］通過二代測(cè)序，與膽汁淤積患者及健康對(duì)照組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)BA患者血漿中的miR-140-3p下調(diào)，有一定的診斷價(jià)值。有趣的是，該研究試圖驗(yàn)證之前已報(bào)道的在人類和BA模型中可能存在miR-200家族、miR-21、miR-29a以及miR-222，但只有miR-200家族的上調(diào)被證實(shí)。BA的發(fā)病與免疫系統(tǒng)的失調(diào)密切相關(guān)，而microRNA可通過多種靶基因及信號(hào)通路影響B(tài)A的發(fā)生發(fā)展及肝纖維化［32］。microRNA成為近年來研究的熱點(diǎn)，在BA的診斷及預(yù)后方面體現(xiàn)出一定的價(jià)值，可通過測(cè)定其水平來預(yù)測(cè)肝纖維化程度［33］。

此外，LncRNA參與BA發(fā)病機(jī)制的研究也在不斷深入。近年來，Xiao等［34］研究指出，LncRNA H19可通過調(diào)控S1PR2／SphK2和let-7／HMGA2軸在BA膽管細(xì)胞增殖及淤膽性肝損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用，LncRNA H19可能是BA非侵入性診斷的生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。Nuerzhati等［35］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA ANXA2P3和ANXA2可能對(duì)肝損傷有保護(hù)作用，被認(rèn)為是BA患者的生物標(biāo)志物。然而，由于缺乏臨床大樣本驗(yàn)證，RNAs目前仍停留在BA病因研究層面，極少應(yīng)用于臨床診斷。基于MicroRNAs在血液循環(huán)中的穩(wěn)定性，未來有望成為BA早期篩查項(xiàng)目之一。

二、影像學(xué)早期診斷

（一）超聲檢查

超聲作為一種無創(chuàng)、簡(jiǎn)便的診斷方法，廣泛應(yīng)用于BA患者的早期診斷。肝門三角形條索征（triangular cord sign，TCS）和膽囊畸形為超聲診斷BA的兩個(gè)重要特征，其中膽囊畸形主要指膽囊缺如、體積小、形態(tài)不規(guī)則、膽囊壁異常、膽囊空虛等［36］。Takamizawa等［37］研究也發(fā)現(xiàn)，結(jié)合肝門三角形條索征、膽囊長(zhǎng)徑及膽囊收縮率可較準(zhǔn)確地診斷BA，該研究團(tuán)隊(duì)將具有TCS≥3 mm、膽囊長(zhǎng)徑＜15 mm、膽囊收縮率＜68%（＜12周）或＜25%（≥12周）特征者判定為陽(yáng)性；并指出當(dāng)TCS及膽囊長(zhǎng)徑均為陽(yáng)性時(shí)，診斷BA的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)98%，而當(dāng)三者均為陰性時(shí)，可完全排除BA。但也有研究指出，超聲三角條索征象無法提示BA病情的進(jìn)展［38］。近年來，有研究提出肝門增大淋巴結(jié)的存在是無創(chuàng)診斷BA的另一個(gè)高度敏感征象，通過肝門部增大的淋巴結(jié)、膽囊分型及肝門三角形纖維塊，多數(shù)BA可被識(shí)別［39］。此外，Wu等［40］報(bào)告了瞬時(shí)彈性成像在BA和膽汁淤積患者鑒別診斷及隨訪中的應(yīng)用，與其他膽汁淤積患者相比，BA患者M(jìn)ETAVIR肝組織學(xué)評(píng)分和肝臟硬度（liver stiffness measurement，LSM）值明顯偏高，建議可以采取瞬時(shí)彈性成像這種非侵入性方法進(jìn)行鑒別診斷［41］。隨著研究的深入，實(shí)時(shí)剪切波彈性成像（ultrasound shear wave elastography，SWE）輔助超聲也被證明可用于BA與其他膽汁淤積性疾病的鑒別［42，43］。

Jonathan等［44］對(duì)28例3月齡以下嬰兒膽汁淤積癥（直接膽紅素＞2 mg／dL）和13例可能的BA患者進(jìn)行前瞻性研究，比較二維超聲、點(diǎn)超聲橫波彈性成像及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)之間的診斷效能。該研究增加了肝臟橫波速度測(cè)量，以探究超聲SWE對(duì)BA及其他膽汁淤積癥患者間的鑒別能力，超聲彈性成像時(shí)的中位年齡為37天（24～52天），在BA及非BA患者之間無差異（P＝0.19），而在BA陽(yáng)性和陰性受試者之間有顯著差異。BA患者的肝纖維化程度可通過實(shí)時(shí)剪切波彈性成像（shear wave elastography，SWE）輔助超聲來反映，表現(xiàn)出較高的靈敏度及特異度，值得進(jìn)一步推廣［45］。Wang等［46］通過建立大鼠膽管結(jié)扎模型，發(fā)現(xiàn)定量超聲造影不僅能反映肝動(dòng)脈增生，還能反映Kupffer細(xì)胞的增加。該研究團(tuán)隊(duì)猜測(cè)，定量超聲造影可能是診斷BA的一種有價(jià)值的非侵入性檢查方法。

（二）肝膽核素顯像

以往研究表明，放射性肝膽核素顯像診斷BA具有較高的靈敏度（98.7%），但特異度較低（33%～80%）［47］。患者檢查前需口服苯巴比妥肝酶誘導(dǎo)劑、使用99m锝標(biāo)記的亞氨基二乙酸衍生物行腸道內(nèi)顯影或腸道、膽囊顯影。據(jù)報(bào)道，苯巴比妥增強(qiáng)肝膽顯像在BA診斷中具有較高的準(zhǔn)確性（靈敏度100%，特異度93%，準(zhǔn)確性94.6%），但此檢查所需時(shí)間較長(zhǎng)，且具有一定的放射性風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)檢查結(jié)果的判讀影響因素較多，在臨床工作中應(yīng)用受限。

（三）MRCP和MRI

MRCP是一種無創(chuàng)傷的膽胰管成像方法，具有安全、簡(jiǎn)便、無需造影劑等優(yōu)點(diǎn)。MRCP能清楚顯示患者擴(kuò)張的肝內(nèi)、肝外膽道系統(tǒng)，可進(jìn)行多方位、多角度的觀測(cè)。MRCP對(duì)于BA的診斷價(jià)值并不大，但是對(duì)先天性膽管擴(kuò)張癥具有較高的診斷準(zhǔn)確性。近年來，有報(bào)道基于MRI的BA診斷決策樹模型使BA與其他嬰幼兒膽汁淤積癥的鑒別診斷準(zhǔn)確率得到提高，靈敏度為97.3%，特異度為94.8%，準(zhǔn)確率為96.2%。目前，將MRCP及MRI聯(lián)合應(yīng)用于BA的診斷得到一定的發(fā)展，但部分導(dǎo)致膽汁分泌異常的因素可致肝外膽道樹識(shí)別不佳，對(duì)BA的診斷造成一定的干擾。同時(shí)該檢查較為昂貴，相比超聲其應(yīng)用有一定的局限性。