利用光電比色法測(cè)定牛精液中精子密度的方法

李明 馮軍 郝濤波

（1，扎蘭屯職業(yè)學(xué)院 162650；2，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗畜牧工作站 162750；3，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市阿榮旗那吉鎮(zhèn)綜合行政執(zhí)法局 162750）

目前，人工授精技術(shù)被廣泛應(yīng)用于牛、羊、豬、禽及特種動(dòng)物繁育中，已顯示出其巨大的、無(wú)可比擬的優(yōu)越性，并已成為其他家畜繁殖技術(shù)的配套技術(shù)。牛冷凍精液的半永久性保存、世界范圍內(nèi)的精液貿(mào)易和冷凍精液配種技術(shù)的普及，使世界優(yōu)秀種公牛優(yōu)質(zhì)精液的利用突破了受母牛配種時(shí)間、國(guó)界、種牛壽命的限制。支撐家畜人工授精這項(xiàng)技術(shù)背后的是一系列跨學(xué)科、跨專(zhuān)業(yè)關(guān)鍵設(shè)備和技術(shù)的推廣和應(yīng)用。精液中精子密度檢查方法的發(fā)展及演變就是一個(gè)很好的例證。

精液中精子密度檢查方法主要有估測(cè)法、血細(xì)胞計(jì)數(shù)法和光電比色法。

1 估測(cè)法和血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢查精子密度的方法及弊端

1.1 估測(cè)法

估測(cè)法是在顯微鏡下檢查精子活力的同時(shí)，依據(jù)視野中精子間的距離，將精子密度粗略劃分為“濃密”“中等”“稀薄”“無(wú)”4 個(gè)等級(jí)。這種方法受人為因素影響大，分級(jí)粗略，不能準(zhǔn)確量化與評(píng)價(jià)精子密度。

1.2 血細(xì)胞計(jì)數(shù)法

血細(xì)胞計(jì)數(shù)法是借用醫(yī)學(xué)上檢查人體血液中紅細(xì)胞數(shù)和白細(xì)胞數(shù)的方法進(jìn)行精子密度檢查。只是把人的血液換成了動(dòng)物精液，把檢查對(duì)象由血細(xì)胞變成精細(xì)胞。動(dòng)物種類(lèi)不同，精子密度也有較大差異。密度較高的動(dòng)物精液中精子數(shù)相當(dāng)于人體血液中的紅細(xì)胞數(shù)，密度較低動(dòng)物精液中的精子數(shù)相當(dāng)于人體血液中的白細(xì)胞數(shù)。因此，檢查密度高的動(dòng)物的精子密度類(lèi)似于檢查血液中的紅細(xì)胞數(shù)；檢查密度低的動(dòng)物的精子密度類(lèi)似于檢查人體血液中的白細(xì)胞數(shù)。

用血細(xì)胞數(shù)法檢查精子密度需要了解計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)室的結(jié)構(gòu)與規(guī)格，用3%鹽水在專(zhuān)用稀釋管中進(jìn)行稀釋、滴入計(jì)數(shù)室、顯微鏡下計(jì)數(shù)及原精液精子密度的換算。從上述描述中不難看出，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢查精子密度，其結(jié)果較為準(zhǔn)確，但方法原始、操作煩瑣、勞動(dòng)強(qiáng)度大。

2 光電比色法檢查精子密度的原理

光電比色儀的研制遵循朗波—比耳（Lawb-Beer）定律，最初被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)，用以測(cè)定化學(xué)物質(zhì)的濃度，又稱(chēng)分光光度計(jì)法[1]。許多化學(xué)溶液是有顏色的，溶液顏色與溶液濃度呈正比，顏色越深，濃度越高。因此，可以通過(guò)測(cè)定溶液顏色深淺來(lái)間接測(cè)定溶液的濃度。當(dāng)一束光線(xiàn)照射裝有一定顏色溶液時(shí)，部分光線(xiàn)將被有色溶液吸收，顏色越濃，光吸收比例越大，透光率越小。這種基于比較溶液顏色深淺測(cè)定溶液濃度的分析方法稱(chēng)為比色分析，又稱(chēng)分光光度法。

動(dòng)物精液同樣具有吸收光的特性，精子密度越高，吸收光越大。因此，利用分析化學(xué)中的光電比色法也可以測(cè)定精液中精子密度。

3 光電比色法在測(cè)定精子密度的方法

光電比色法測(cè)定精子密度是指利用光電比色儀通過(guò)測(cè)定已知精子密度的精液的透光率，建立透光率和精子密度的回歸方程或標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，再通過(guò)測(cè)定未知密度精液的透光率，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或查透光率與精子密度對(duì)照表而獲知被測(cè)精液中的精子密度[2]。

3.1 分光光度計(jì)使用方法

打開(kāi)儀器預(yù)熱20min。用“波長(zhǎng)設(shè)置”旋鈕將波長(zhǎng)設(shè)置在550nm。取一支比色杯，加入3/4 量的已配制好的精液稀釋液作為空白對(duì)照液，然后進(jìn)行“調(diào)100%”或“調(diào)零”操作。

3.2 采集家畜的精液并取樣

利用假陰道法采取種公牛精液作為被測(cè)樣品。

3.3 測(cè)定精子密度

用血細(xì)胞計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確測(cè)定被測(cè)樣品的精子密度。為了計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，將每個(gè)樣本進(jìn)行兩次檢查計(jì)數(shù)，且相對(duì)誤差不得超過(guò)10%，若誤差超過(guò)此標(biāo)準(zhǔn)，需要進(jìn)行第3 次重復(fù)計(jì)數(shù)，取2 個(gè)數(shù)值相近的結(jié)果作為最終結(jié)果。

3.4 稀釋被檢精液

對(duì)已知精子密度的原精液用0.9%氯化鈉溶液作1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100 的稀釋。稀釋后各濃度的精子密度可換算得知。

3.5 用光電比色法檢查不同密度梯度的精液的透光率

經(jīng)過(guò)儀器預(yù)熱、選定波長(zhǎng)、空白液“調(diào)零”等操作后，測(cè)定出不同密度梯度精液的透光率，記錄測(cè)定結(jié)果。

3.6 建立透光率和精子密度的線(xiàn)性模型，繪制反映透光率和精子密度間關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

在標(biāo)準(zhǔn)坐標(biāo)紙上以透光率為橫坐標(biāo)，以精子密度為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)透光率與精子密度的變化規(guī)律，對(duì)照坐標(biāo)圖中形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的每個(gè)點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的透光率與精子密度的數(shù)值，形成透光率與精子密度對(duì)照表[3]。

值得一提的是，在不同型號(hào)的光電比色儀顯示器上有兩組讀數(shù)，除了顯示透光率外還標(biāo)有光密度，兩組數(shù)據(jù)可通過(guò)數(shù)學(xué)運(yùn)算進(jìn)行換算，在生產(chǎn)實(shí)踐中，測(cè)定結(jié)果可選擇不同的名稱(chēng)（透光率或光密度）去表示。即形成的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或?qū)φ毡矸从车囊部墒枪饷芏扰c精子密度間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。另外，在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)，透光率（或光密度）與精子密度也可對(duì)調(diào)坐標(biāo)，其變化規(guī)律和對(duì)應(yīng)的數(shù)值關(guān)系是一致的。

3.7 透光率（或光密度）與精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖或?qū)φ毡淼膽?yīng)用及精液中精子密度的測(cè)定

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或?qū)φ毡砗螅瑢?duì)生產(chǎn)實(shí)踐中未知精子密度的精液只需用光電比色儀測(cè)定出其透光率（或光密度），即可根據(jù)透光率（或光密度）與精子密度標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖或?qū)φ毡恚扑愠龌虿槌霾煌腹饴剩ɑ蚬饷芏龋┫碌木用芏取８鶕?jù)經(jīng)驗(yàn)，在測(cè)定精液樣品時(shí)，將牛的原精液先稀釋80～100 倍，再測(cè)其透光值效果較好。

比色分析具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于微量組分的測(cè)定，通常測(cè)定含量在10-1～10-4mg 轅L 的痕量組分。在用比色法檢查精子密度時(shí)，若在建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)時(shí)能選擇20個(gè)以上的稀釋濃度，利用Eviews 或Excil 軟件操作系統(tǒng)進(jìn)行處理，可得到線(xiàn)性回歸方程，將測(cè)得的透光率（或光密度）值代入回歸方程，即可準(zhǔn)確計(jì)算出被測(cè)精液中精子的密度。如能用計(jì)算機(jī)進(jìn)行程序化計(jì)算并連接打印系統(tǒng)，其結(jié)果的計(jì)算、顯示和存貯將更為準(zhǔn)確、便捷、清晰。