母源-合子轉換期中合子基因組激活的研究進展

趙向遠，許保增*

（1.中國農業科學院特產研究所，吉林長春 130112；2.中國農業科學院特種經濟動物分子生物學重點實驗室，吉林長春 130112）

胚胎發生始于精子和卵子的融合。19 世紀，Theodor Boveri 等[1]利用海膽胚胎研究細胞成分與遺傳之間的關系，發現不同種類配子間的交叉受精產生了具有雙親中間特性的幼蟲，表明遺傳決定因素編碼在精子貢獻的核物質中。然而，在人工生產的無核卵子的雜交中也觀察到一系列雜交特征[2]，這意味著母體也給予了一定程度的遺傳貢獻。

最初，胚胎在轉錄上是靜止的，發育完全由母體提供的蛋白質和核糖核酸來決定。隨后，在母子-合子轉換期（Maternal-To-Zygotic Transition，MZT），發育調控由激活的合子基因組進行，MZT 主要包含2 種分子活動，它們共同“重新編程”最終分化的卵母細胞和精子，使之成為全能的胚胎。一種是母體產物的降解，即母體指令的缺失，這些指令是卵母細胞成熟、內環境穩定和胚胎發生第一階段所必需的，但隨著胚胎的發育而變得不必要或是有害；另一種是通過基因表達激活新的合子指令，這一過程被稱為合子基因組激活（Zygotic Genome Activation，ZGA）。這兩種活動極大地重塑了胚胎的基因表達模式和細胞特性[2]。本文綜述了ZGA 的動力學和時序模型及ZGA 的調控機制，包括在多個模型物種中對細胞周期長度、轉錄抑制因子和激活因子的作用和染色質組的研究情況，以及翻譯后水平的調控變化，更全面地了解ZGA 在MZT 過程中發揮的作用，以確保胚胎發育的穩定進行。

1 合子基因組激活的模型和時序性

1.1 合子激活的模型假說 在傳統上，2 種截然不同的激活模式一直是ZGA 研究的重點。一方面，“核質（N/C）比”模型認為，細胞周期的早期分裂可以通過改變N/C 比來調節合子基因組的激活，即整個胚胎的細胞質體積相對恒定，但通過進行性細胞分裂，細胞核數量以及整體細胞核的體積都在增加，會增加N/C 比，降低母體中抑制因子的比率，從而導致每個細胞核中的遺傳物質從被轉錄的狀態中釋放出來[3]。在這個公式中，ZGA發生的障礙是母體的因素，在轉錄發生之前母體的相應轉錄水平必須降低。例如，在非洲爪蟾和斑馬魚中都觀察到細胞周期的變化與N/C 比有關，但有證據表明，N/C 比通過調節細胞周期速率會間接影響轉錄激活[4]。Edgar 等[5]研究發現，在細胞化之前，黑腹果蠅的有絲分裂周期長度會根據N/C 降低比而變慢，但該機制不能解釋所有ZGA 的發生。

另一方面，與上述觀點相對的是獨立于細胞分裂數量的“母系時鐘”模型，它可能決定基因表達的時間。該模型的分子實例化可被看作是母體因子數量或活性的增加，其必須達到一個臨界水平，啟動一個生化級聯反應才能觸發轉錄激活。胚胎受許多母體mRNA 因素的影響，這些因子通常通過抑制性RNA 結合蛋白處于休眠狀態，即使在這種抑制被釋放后，這些轉錄物被多聚腺苷酸化、翻譯并運輸到細胞核也需要時間。因此，激活轉錄或減輕抑制所需的任何必需因子的積累都可能有觸發ZGA。到目前為止，在斑馬魚和果蠅體內已經發現部分與基礎轉錄相關的母體清除因子和轉錄激活因子，如Smaug[6]。這2 個模型并非相互不容，也不相互獨立。在黑腹果蠅的研究中表明，這2 種調節模式對于數量大致相等的基因的激活同時存在[7-8]。然而，所有這些機制也依賴于可用的DNA 模板的相對數量，在每個細胞周期后，模板數量呈指數增長。達到DNA 的閾值數量，并允許有足夠的時間積累轉錄數，是實現可檢測水平的轉錄輸出的一個因素。ZGA 調節的機制實際上可能比使用現有技術測量的時間更早發生作用。

1.2 合子激活的時序性 在許多物種中，ZGA 不是一個單一的生物學事件，而是一個轉錄逐漸被激活的過程。植入前胚胎的ZGA 主要經歷2 個階段，一種是在分裂過程中出現的小波；另一種是與細胞周期延長而同時出現的大波[9]。合子轉錄的間斷爆發構成了ZGA 的一個小波和一個大波，在大波中發生的基因表達的重編程對于合子進一步發育十分關鍵[9]。就胚胎有絲分裂的細胞周期而言，人、小鼠和海膽最早開始轉錄，在小鼠的第1 個細胞周期的G2 期，檢測到第1 個胚胎轉錄本，并在受精后約20 h 雌雄原核融合，開始第1 次胚胎分裂[2]。小鼠胚胎ZGA 的小波發生在單細胞期[10]，約有800 個基因被激活；而大波發生在雙細胞期，這次轉錄會激活約 3 500 個基因。與小鼠相比，其他哺乳動物的表達模式有輕微延遲的趨勢[11]，如牛的小ZGA 發生在2/4 細胞期，大ZGA 發生在8 細胞期。人類的合子基因組激活也分為小波和大波2 個波次：在2～4 細胞階段，激活約1 000 個基因，而在4～8 個細胞階段的大波過程中，激活約2 500 個基因，人類胚胎在1 個細胞階段也具有轉錄活性[2]。但在無脊椎動物中，如非洲爪蟾的基因組激活的小波發生在第6～9 個卵裂周期，而大波發生在受精后約6 h 的第12～13 個卵裂周期；斑馬魚的ZGA 開始于受精后的第6 個卵裂周期，并在第10 個卵裂周期（受精后約19 h）時觀察到大波出現；在果蠅中，ZGA 的小波發生于第6 個卵裂期，大波在第14 個卵裂周期（受精后約2.5 h）被檢測到[12-15]。對于大多數基因而言，ZGA 期間轉錄的開始是隨機的，這意味著并非所有細胞都同時開始激活該基因[16]，這會導致最初基因的表達水平在不同細胞之間存在巨大差異，從原則上講，這可能會阻礙發育。然而，通過發育過程中空間或（如在果蠅中）[17]或時間的合理分配（如在斑馬魚中）[16]可以達到基因表達的統一模式，從而克服這個問題。盡管在ZGA 過程中被激活的基因中有一些是嚴格的合子（即不是母系遺傳的），但也有許多基因是母系遺傳的，然后在胚胎中重新表達。在這些情況下，轉錄不僅加強了基因的表達，還改變了轉錄的特征及其調控。

2 合子基因組激活的分子機制

2.1 細胞周期的調控 在昆蟲、兩棲動物和魚類的早期胚胎發育階段具有快速卵裂的特點。因為DNA 復制通常會干擾轉錄，細胞周期的增多可能會減少發育早期階段的基因轉錄。例如，在非洲爪蟾中，發現有4 個復制因子Cut5、RecQ4、Treslin 和Drf1 控制細胞周期，從而指導合子轉錄的開始，這些基因的過表達會導致復制起始和細胞周期數的增加，囊胚中期（Mid-Blastula Transition，MBT）細胞分裂不均勻，從而延遲了大量基因的轉錄。此外，在這一過程中還觀察到復制檢查點激酶Chk1 的早期激活[16,18]。Chk1 通過抑制細胞周期蛋白依賴性激酶的活性來調節細胞進入S 期和G2 期，Cdc25 同系物Twine 參與該過程，它可能以N/C 比率依賴性的方式進行降解，穩定Cdk1 磷酸化來防止有絲分裂的進行從而允許合子轉錄發生[19]。其他研究顯示，ATM、ATR 以及下游的CHK1 或CHK2 通過下調CDC25，上調WEEL，最終使 CDK1/周期蛋白 B（Cyclin B）的活性受到抑制，導致細胞被阻斷在G2/M 期[20-21]。因此，這些機制可能共同作用于非洲爪蟾的細胞周期延長和相關的合子轉錄的增加。然而，在果蠅胚胎中，細胞周期的延長取決于合子轉錄的開始[22]，轉錄并非依賴于細胞周期的延長。因此，目前還不清楚在胚胎發生過程中細胞周期的延長對轉錄開始的影響程度。上述物種在MBT 后才進行了合子的轉錄，與之不同的是，N/C 比并不適用于哺乳動物，小鼠在胚胎2-細胞時期就開始了合子轉錄[20]，但N/C 比對小鼠的胚胎發育和細胞致密化有很重要的影響[23]。

在許多物種中，早期胚胎發育的特點是一系列細胞周期的快速進行，而這一細胞分裂的減慢與合子的激活階段密切相關。當細胞核進入有絲分裂時，轉錄在很大程度上被抑制，因此在發育早期表達的基因往往很短且缺乏內含子。隨著分裂周期的減慢，基因組的轉錄數量逐漸增加，隨著細胞進入第1 個G2 期，ZGA 的大波出現。綜上表明，早期轉錄的基因往往很短，而較長的基因表達則被延遲，直到細胞周期延長。因此，分裂周期的減慢可以決定基因組激活的速度[6]。

2.2 染色質的變化 在植入前胚胎的ZGA 過程中受調控基因激活的爆發很可能伴隨著細胞核內DNA 堆積方式的改變。DNA 在復制轉錄的過程中需要先將DNA 的緊密結構打開，從而允許一些調控因子或轉錄因子結合。這部分打開的染色質叫開放染色質，打開的染色質允許其他調控因子結合的特性稱為染色質的開放性。例如，染色質可以乙酰化或甲基化，從而改變其物理結構，幫助潛在的基因被激活或抑制。開放性反映了染色質轉錄的活躍程度，以及結合其他DNA 修飾（如甲基化）的信息，特定條件下的染色質開放性變化可以提供大量的基因表達調控信息，因此是轉錄調控的關鍵[24]。

一般來說，在MZT 轉錄不活躍期間，染色質結構相對開放。例如，人類和老鼠的基因組在受精后會發生DNA 去甲基化[25]，但這在其他物種中尚未觀察到。更普遍的是，早期胚胎染色質結構開放的特征是高度分散，異染色質結構域缺失，拓撲相關域（Topologically associating domains，TAD）缺失，高水平組蛋白乙酰化和高染色質流動性[26-27]。在小鼠中，高度的染色質開放性似乎是引發ZGA 的先決條件。在合子核融合之前，未凝聚的雄原核具有轉錄能力，并在S 期的中后期，較低水平的內源性轉錄導致了ZGA 小波的發生[28]。相反，雌原核在轉錄上保持沉默。這種轉錄上的不對稱可能是由于父本基因組重新包裝引起的短暫的染色質開放狀態。精子DNA 與富含精氨酸的精蛋白結合，在S 期前與母體組蛋白進行交換[29]。這些新結合的組蛋白受到轉錄模式的修飾，包括H4 高乙酰化和H3K9 和H3K27單甲基化等[30]。

總體而言，ZGA 發生時，基因組的整體結構變得更加緊湊，而局部染色質開放性增強，這使得越來越多的轉錄因子成功地與DNA 結合[31]。雖然染色質開放程度增強有利于轉錄因子的結合，但開放性又往往依賴于特定轉錄因子的結合。因此，抑制因子的缺失、激活因子的積累和染色質開放性的局部變化共同啟動了基因組的激活[32]。

2.3 轉錄抑制因子和激活因子 為了啟動轉錄，Pol-II不能自行識別和結合目標基因的啟動子，它必須依賴于識別啟動子和增強子內DNA 元素的DNA 結合蛋白，此外，Pol II 的結合還依賴于特定的轉錄因子（TFs）。這些TFs 能夠識別并結合到增強子區域內的特定DNA序列，使它們能夠選擇性地激活不同細胞中靶基因的表達來調節轉錄[33]。在合子轉錄過程中，來自于母體的很多具有轉錄抑制能力的蛋白質對MZT 過程中的轉錄起到了促進作用。例如，在黑腹果蠅中，Tramtrack（TTK）是fushi-tarazu（ftz）基因表達的母體抑制劑[2]。隨著N/C 比增加，TTK 的核濃度開始降低，減少TTK的數量或TTK 的結合位點會導致ftz 轉錄提前，而增加TTK 數量則產生相反的效果。但有趣的是，Smaug 對TTK mRNA 的降解具有調節作用。Smaug 的缺失對合子基因的表達有廣泛影響，可能超過了TTK 對轉錄的影響，這表明Smaug 會對與ZGA 有關的許多其他未知的抑制因子有抑制作用[34-35]。因此提供了母體mRNA與ZGA 之間的聯系。

對小鼠而言，TIF1α是胚胎早期合子基因轉錄調控的最早因子之一，在早期合子基因轉錄開始時，TIF1α從細胞質轉移到原核。在原核中，TIF1α通過啟動Ser5Phos Pol II 5 號絲氨酸磷酸化和2 個染色質重塑復合物的催化亞基共定位到離散的位點，即SWI/SNF 復合物的BRG1（SMARCA4）和ISWI 復合物的SNF2H（SMARCA5）。當TIF1α被抑制時，靶基因被Pol II、BRG1 和SNF2H 錯誤調控，會導致胚胎30% 的合子基因水平降低和2 細胞階段的阻滯，其中一些基因也依賴于SNF2H 表達[28]。

與核心啟動子結合以激活基礎轉錄的TFIID 復合物的組成部分是轉錄激活的另一個調控方面。例如，在線蟲中，一般的TAF-4 轉錄因子在發育的早期階段是無法轉錄的，因為該蛋白被磷酸化的OMA-1 和OMA-2隔離在細胞質中，阻止了TFIID 在第1 次分裂時裝配到細胞核DNA 上，直到在4 細胞階段OMA-1/2 自身被降解，TAF-4 才被釋放并轉移到細胞核中開始轉錄[36]。同樣地，在非洲爪蟾中，另一個TFIID 亞基，TATA 結合蛋白（TATA-Binding Protein，TBP）是轉錄的限速因子。一般情況下，TBP 轉錄因子的濃度在ZGA 發生前是被抑制的。雖然TBP 的mRNA 由母體提供，但直到早期囊胚階段才能檢測到其蛋白水平。在小鼠中，TBP 缺失導致囊胚發育過程中轉錄激活失敗，盡管這種現象只在Pol I 和III 介導的轉錄中發現[37]。

因此，一般轉錄因子在發育早期的缺失導致了轉錄活性受到抑制。在小鼠中，發育僅進行到第2 個有絲分裂階段就會停滯（通常稱為2 細胞阻滯）。在這些生物體中，ZGA 早在這些缺陷出現之前就已經發生，這表明合子轉錄不僅要使體內轉錄的RNAs 保持平衡，而且對指導新的發育程序的進行也至關重要。在此之后，基因特異性轉錄開始需要基因特異性轉錄因子。激活合子表達基因的轉錄因子已在多個物種中被發現，包括果蠅（Zelda）、斑馬魚（Pou5f3，Sox19b，Nanog）、人類（OCT4，DUX4）和小鼠（Dppa2，Dppa4，Nfy，Dux）[38]。這些基因的聯合缺失對轉錄和胚胎的后續發育都有很大影響。編碼這些因子的RNA 是母系遺傳的，它們的蛋白質水平在細胞周期的早期有所增加[39]。在這種情況下，它們的合子轉錄開始于細胞核的2 個不同區域，可能導致轉錄因子濃度局部升高，從而促進轉錄，這類基因特異性轉錄因子的水平影響了轉錄開始的時間。這表明在ZGA 過程中，特異性和一般性的抑制因子和轉錄因子都在從轉錄抑制到轉錄激活的平衡過程中發揮重要作用。

3 合子轉錄的翻譯后調控

3.1 組蛋白修飾 由于組蛋白能以高親和力與DNA 結合并在胚胎中大量存在，因此組蛋白一直被認為是轉錄的抑制因子。組蛋白在經過一系列的翻譯后修飾（Post-Translational Modifications，PTMs）可以直接影響染色質的開放性，例如，乙酰化改變了組蛋白的電荷，進而改變了組蛋白與DNA 的接觸。在MZT 過程中，特定類型的組蛋白修飾與轉錄的抑制和激活狀態有關。在小鼠中，H4 乙酰化會將轉錄活躍的雄原核和沉默的雌原核區分開[40]。在ZGA 的小波發生后，組蛋白去乙酰化酶（Histone Deacetylase，HDAC）的活性會提供短暫的轉錄抑制，例如注射的質粒以及通常在1 細胞階段表達的內源性基因往往在2 細胞胚胎中不易轉錄。抑制HDACs 或DNA 合成可以緩解這種抑制現象，這表明在復制過程中的去乙酰化為ZGA 提供了轉錄特異性[40]。

基因啟動子區的H3K4me3 和H3K27ac 與激活基因表達相關，而H3K9me3 和H3K27me3 通常與抑制表達相關。在果蠅、斑馬魚和小鼠胚胎中，H3K27ac與ZGA 期間激活的基因有關[41]。H3K27ac 會在果蠅ZGA 發生之前的的TSS 基因位點處富集，在小鼠的2細胞胚胎階段也伴隨著H3K27ac 的增加[41]。這些發現表明H3K27ac 在ZGA 之前的積累和對相關啟動子的識別是必需的，并且先于轉錄激活。因此，在ZGA 前H3K27ac 的積累是不同生物體的共同特征[42]。

除了乙酰化，H3 賴氨酸甲基化也會影響MZT 中基因激活的時間，盡管它們的影響在不同物種和環境中差異很大[43]。在小鼠中，無轉錄活性的雌原核與H3K27me3 相關，而轉錄活性強的雄原核僅在小ZGA末期出現H3K27me3[44-45]。然而，H3K4me3 的激活也優先在雌原核中觀察到，盡管它的轉錄處于靜止狀態，但隨著雄原核的加入與母體H3 組蛋白結合，這種不對稱性迅速減弱[46]。因此，H3K27me3 更容易影響早期小鼠基因轉錄活性。

上述結果表明，組蛋白修飾決定了MZT 期間基因表達的時間和空間特異性，這與受精卵基因染色質構象的局部變化有關。盡管有證據表明配子的表觀遺傳在這一過程中也發揮了一定作用，但這種特異性是如何建立起來的，在很大程度上仍然是未知數。

3.2 表觀遺傳模式 在卵子和精子中組蛋白修飾標記的發育基因表明組蛋白的標記對ZGA 的基因表達程序有預測作用。例如，在小鼠的卵母細胞中，激活Polycomb 復合物蛋白（PcG）的活性被證明是胚胎中組蛋白正確標記和維持卵母細胞發育所必需的[46-47]。Polycomb 的抑制復合物1 和2（PRC1 和PRC2）共同作用并維持H3K27me3 并抑制轉錄。由缺乏PRC1 核心成分Ring1 和Rnf2 的卵母細胞來源的小鼠胚胎在2 細胞期停止生長，并在ZGA 過程中出現異常基因表達[48]。同樣在小鼠和人類精子DNA 中，精蛋白中都存在少量的修飾組蛋白，這些組蛋白會傳遞到雄原核中[24,40,49]。H3K4me2、H3K4me3 和H3K27me3 都出現在與發育有關的精子啟動子上，后者最先在胚胎中發現，與抑制基因表達有關。

此外，富含G/C 的區域也很重要，因為它們是5-甲基胞嘧啶修飾的位點，這些修飾與轉錄靜止區有關。CpG 二核苷酸處的胞嘧啶甲基化由DNA 甲基轉移酶（如Dnmt1）催化，甲基轉移酶活性的抑制導致MZT期間許多合子基因過早表達[50]。與組蛋白標記一樣，精子DNA 中也存在特定的甲基化模式，但這些甲基化模式在受精時基本消失，只在囊胚中重新出現[49,51]。因此，轉錄能力以及基因表達的特異性是通過調節染色質的可及性來實現的。核小體重定位、組蛋白修飾和轉錄DNA 甲基化的結合保證了MZT 中轉錄的發生。

4 展 望

合子的基因激活在MZT 過程中是一個多方面多因素調控的結果。在不同物種間，MZT 的過程基本是保守的，但是基因的轉錄和激活在許多方面有著驚人的相似和相通性。深入了解這一過程中細胞周期的變化、轉錄因子的狀態和染色質的開放程度如何相互關聯，以及它們在多大程度上影響了合子的轉錄激活，才能盡快對早期胚胎中基因組激活的時間和分化機制做出更深一步解釋。

因此，一些母體產物的清除是合子的基因組激活所必需的，但這是如何完成的，ZGA 主要過程之間的因果關系以及涉及到的因素，仍然在很大程度上是未知的。雖然很容易推測有一些機制會直接連接這兩種RNA 的代謝活動，但它的發生到底是由幾個獨立機制的累加作用引起的，還是通過一系列單一控制點的分子時間所引發的，目前尚不清楚。近幾年來，隨著科學技術手段的進步，可以通過高通量基因組學及轉錄組學分析，利用高精密度的儀器和更少的實驗樣本去探究ZGA 過程中的轉錄調節和染色體狀態，甚至是單個胚胎的發育情況。未來還需要進一步的研究來揭示胚胎早期發育過程中ZGA 階段的關鍵候選基因及其動力學機制，這對了解哺乳動物早期胚胎的發育進程有著十分重要的意義，同時為動物繁育技術的開展和應用提供了理論基礎和技術支持。