飼用益生菌凝結芽孢桿菌抑菌性能的研究

柳成東，肖明霞，李琦華，程志斌

（云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，云南昆明 650201）

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部（第194 號公告）定于2020 年7月1 日起全面禁止促生長藥物飼料添加劑的使用，包括飼用益生菌等諸多替抗類產(chǎn)品的篩選及應用成為重要研究方向[1]。凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是分泌乳酸的芽孢桿菌屬益生菌，近年來成為研究熱點[2]。已有動物飼養(yǎng)試驗顯示，飼糧中添加單一凝結芽孢桿菌能通過抑制大腸桿菌、沙門氏菌等腸道主要有害菌，顯著改善畜禽生長性能[3-5]；也有報道稱，凝結芽孢桿菌與其他飼用益生菌組合的飼喂效果低于單一凝結芽孢桿菌[3,6]。由此可見，飼用益生菌等添加劑替抗的動物飼養(yǎng)試驗易受試驗動物、試驗場地、試驗條件等因素的影響，試驗結果重復性不穩(wěn)定[7-8]，且動物飼養(yǎng)試驗的周期較長、費用高。因此，針對凝結芽孢桿菌等替抗產(chǎn)品性能的初步篩選，建立科學、高效的體外實驗室評估方法，有助于提高動物飼養(yǎng)試驗的研發(fā)效率和可重復性[7-8]。

牛津杯法已用于凝結芽孢桿菌的體外抑菌性能評估[9-15]，然而現(xiàn)有的報道存在2 個問題：其一，凝結芽孢桿菌抑菌作用的研究不系統(tǒng)。目前，凝結芽孢桿菌對腸道有害菌[12-15]及飼料源有害菌[9,12]抑制作用的研究較多，對多種商業(yè)飼用益生菌的抑制研究報道較少[9-10,12]，且對乳酸桿菌等腸道有益菌的抑制研究沒有報道；其二，凝結芽孢桿菌的抑菌效果不明確。已報道的凝結芽孢桿菌牛津杯法抑菌試驗均沒有設計抗生素對照組，這不利于比較確定凝結芽孢桿菌的抑菌效果。據(jù)此，本研究以廣譜抗菌藥物飼料添加劑金霉素和土霉素為參照，采用牛津杯法較為系統(tǒng)地評估凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有害菌、腸道有益菌、飼料源有害菌、商業(yè)飼用益生菌等的抑菌作用及效果，為其在畜禽生產(chǎn)中的應用提供參考。

1 材料與方法

試驗中11 個指示菌包括4 類。腸道有害菌：大腸桿菌K88（Escherichia coliCGMCC1.2385）、大腸桿菌K99（Escherichia coliBNCC125787）、豬霍亂沙門氏菌（Salmonella choleraesuisBNCC186354）、雞白痢沙門氏菌（Salmonella pullorumBNCC124693）；腸道有益菌：羅伊氏乳酸桿菌（Lactobacillu reutreriATCC55730）；飼料源有害菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusBNCC186335）；商業(yè)飼用益生菌：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilisATCC PTA-6737）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisbio-58806）、屎腸球菌（Enterococcus faeciumbio-67122）、糞腸球菌（Enterococcus faecalisBNCC192631）、產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utiliBNCC336517）。以上菌株購買自北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司和北京百歐博偉生物科技有限公司。

1.2 試驗設計 設金霉素組、土霉素組、凝結芽孢桿菌組3 個處理組，采用牛津杯法對比評估凝結芽孢桿菌對以上4 類11 個指示菌的抑制效果。

1.3 牛津杯抑菌試驗步驟及抑菌作用判定

1.3.1 凝結芽孢桿菌及指示菌的培養(yǎng) 凝結芽孢桿菌培養(yǎng)參考課題組前期報道[16]；指示菌大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等采用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)；指示菌羅伊氏乳酸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母等采用MRS 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3.2 指示菌涂布平板制備 將涂布平板所用的MRS 固體培養(yǎng)基在121℃滅菌30 min，冷卻至45℃后倒入無菌培養(yǎng)皿[14]。凝固后，待水分干燥，即可涂布。

1.3.3 指示菌液稀釋涂布 ①將培養(yǎng)24 h 的大腸桿菌K88 和K99、豬霍亂沙門氏菌、雞白痢沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌的菌液吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，進行梯度稀釋至10-5涂布。每次操作，每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿（3 次平行測定）。②將培養(yǎng)24 h 的伊氏乳酸桿菌、屎腸球菌、糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母菌液吸取800 μL，轉(zhuǎn)入裝有7.2 mL 無菌水的EP 管，進行梯度稀釋至10-3涂布。每次操作，每個指示菌涂3 個培養(yǎng)皿（3 次平行測定）。

1.3.4 牛津杯抑菌測定 為統(tǒng)計比較3 個處理組（金霉素，I 組；土霉素，II 組；凝結芽孢桿，III 組）對某一個指示菌的抑制效果，每個指示菌吸取200 μL 涂布1個培養(yǎng)皿，并在每個培養(yǎng)皿中放置3 個牛津杯，分別用于加入100 μL 的金霉素、土霉素、凝結芽孢桿菌菌液。然后，37℃恒溫培養(yǎng)24 h[14]，之后測定抑菌圈直徑（Diameter of Inhibition Zone，DIZ）。以抑菌圈直徑最大值和最小值的平均值確定抑菌圈直徑，并用于抑菌作用判定和抑菌效果比較分析。

1.3.5 抑菌作用判定方法 凝結芽孢桿菌抑菌作用判定目前尚無統(tǒng)一標準，本研究參考李靜舒等[15]報道，并依據(jù)所用牛津杯的直徑值（7.8 mm），將牛津杯外徑的約2 倍16.0 mm 區(qū)分為“敏感”與“高敏感”，因此判定設定標準：“不敏感”，DIZ=7.8 mm；“敏感”，7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm；“高敏感”，DIZ＞16.0 mm。

4.應有落地問題上的挑戰(zhàn)。工信部信息中心此前發(fā)布的《2018年中國區(qū)塊鏈產(chǎn)業(yè)白皮書》顯示，截至2018年3月底，我國以區(qū)塊鏈為主營業(yè)務的區(qū)塊鏈公司數(shù)量已超過450家，中國區(qū)塊鏈產(chǎn)業(yè)初步形成規(guī)模。但這其中大部分的項目無法落地。

1.4 統(tǒng)計分析 對處理組之間的抑菌圈直徑數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和LSD 多重比較，P＜0.05 表示差異顯著，分析采用SAS9.4 統(tǒng)計軟件。

2 結果

2.1 凝結芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制作用 表1和圖1 可知，凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用達到“高敏感”（DIZ=19.8 mm）；相反，金霉素和土霉素對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用判定為“不敏感”（DIZ=7.8 mm）。凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K99 的抑制作用達到“敏感”（7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm），且與金霉素、土霉素的抑菌作用差異不顯著（P＞0.05）。凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88 和雞白痢沙門氏菌的抑制作用也達到“敏感”（7.8 mm＜DIZ ≤16.0 mm），然而其抑制作用小于（P＜0.05）金霉素和土霉素。由此可見，4 個腸道主要有害菌中，凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制效果最顯著。

表1 凝結芽孢桿菌與金霉素、土霉素對畜禽腸道主要有害菌的抑制作用 mm

圖1 凝結芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制效果

2.2 凝結芽孢桿菌對腸道主要有益菌乳酸桿菌的抑制作用 由圖2 可知，凝結芽孢桿菌對畜禽腸道主要有益菌乳酸桿菌（羅伊氏乳酸桿菌）抑菌作用，判定為“不敏感”（DIZ=7.8 mm）；相反，金霉素、土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑菌圈直徑分別為24.3 mm、24.1 mm，判定為“高敏感”。

圖2 凝結芽孢桿菌與金霉素、土霉素對畜禽腸道主要有益菌羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用

2.3 凝結芽孢桿菌對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用 由圖3 可知，凝結芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為14.7 mm，判定為“敏感”；且抑制效果小于金霉素（DIZ=28.6 mm，高敏感）和土霉素（DIZ=28.4 mm，高敏感）（P＜0.001）。

圖3 凝結芽孢桿菌與金霉素、土霉素對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 凝結芽孢桿菌對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用由表2 和圖4 可知，凝結芽孢桿菌對糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母的抑制作用，判定為“不敏感”。凝結芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用達到“敏感”（DIZ=11.3 mm），且抑制作用小于金霉素（DIZ=14.0 mm）（P＜0.001），但大于土霉素（DIZ=9.6 mm）（P＜0.001）。凝結芽孢桿菌對地衣芽孢桿菌、屎腸球菌的抑制作用也達到“敏感”，且抑制作用小于金霉素和土霉素（P＜0.001）。

圖4 凝結芽孢桿菌對商業(yè)飼用益生菌的抑制效果

表2 凝結芽孢桿菌與金霉素、土霉素對主要商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 mm

3 討 論

3.1 凝結芽孢桿菌對腸道主要有害菌的抑制作用 豬霍亂沙門氏菌感染易引發(fā)仔豬副傷寒，是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常見的腸道傳染病之一，導致仔豬嚴重下痢和敗血癥，病死率高[17]。本研究中，凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用判定為“高敏感”。嚴濤等[13]報道，從泡菜中分離的5 株凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌均有較強的抑制作用，這與本試驗結果一致。相反，廣譜抗菌藥物金霉素、土霉素對豬霍亂沙門氏菌無抑制作用。王俊紅[17]發(fā)現(xiàn)豬霍亂沙門氏菌對土霉素有較強耐藥性。以上表明，相比于金霉素、土霉素對豬霍亂沙門氏菌無抑制作用的結果，凝結芽孢桿菌具有開發(fā)應用于預防與治療仔豬副傷寒的潛力。

大腸桿菌K88、大腸桿菌K99 和雞白痢沙門氏菌是畜禽腸道最常見的致病菌，嚴重引發(fā)豬、雞腹瀉，降低生產(chǎn)性能[18-19]。本研究結果顯示，凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99 和雞白痢沙門氏菌的抑制作用均為“敏感”。汪攀等[14]采用牛津杯法研究結果也顯示，凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K99 具有顯著的抑制作用。本研究首次發(fā)現(xiàn)，凝結芽孢桿菌抑制大腸桿菌K99 的效果等同于廣譜抗菌藥物土霉素，且強于金霉素。此外，凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88 和雞白痢沙門氏菌有抑制作用，這與前人的報道基本一致[11,14]，且本研究進一步證明了凝結芽孢桿菌對大腸桿菌K88 和雞白痢沙門氏菌的抑制效果弱于金霉素和土霉素。

以上分析綜合表明，凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制效果優(yōu)于廣譜抗菌藥物金霉素和土霉素，對大腸桿菌K88、大腸桿菌K99 和雞白痢沙門氏菌有顯著抑制作用。因此，針對畜禽腸道主要有害菌而言，飼用益生菌凝結芽孢桿菌具有替代抗生素抑菌，進而改善畜禽生產(chǎn)性能的潛能。以上牛津杯抑菌試驗結果也與飼用凝結芽孢桿菌對豬雞生長性能及腸道菌群影響的研究結果一致[3,5,20]。

3.2 凝結芽孢桿菌對腸道主要有益菌的抑制作用 乳酸桿菌是豬雞等畜禽腸道的主要有益菌，對維持腸道菌群平衡、保障機體健康有重要作用[21]。畜禽腸道中乳酸桿菌的種屬很多，其中羅伊氏乳酸桿菌分布最廣泛、比例最高[22]。本試驗首次對比研究了凝結芽孢桿菌、金霉素和土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用，結果顯示凝結芽孢桿菌對羅伊氏乳酸桿菌沒有抑制作用；而金霉素和土霉素對羅伊氏乳酸桿菌的抑制作用達到“高敏感”。因此，就畜禽腸道主要有益菌而言，飼用益生菌凝結芽孢桿菌在維持腸道菌群平衡方面的作用效果，顯著優(yōu)于飼用抗生素。動物飼養(yǎng)試驗研究也顯示，飼糧單一添加適合劑量的凝結芽孢桿菌能夠維持或提高腸道乳酸桿菌數(shù)量，從而有效替代抗生素改善仔豬和肉雞生長性能[3,5,23-24]。

3.3 凝結芽孢桿菌對飼料源有害菌金黃色葡萄球菌的抑制作用 金黃色葡萄球菌是飼料及飼料原料的主要污染有害菌之一，動物攝入污染金黃色葡萄球菌的飼料，腸道及肝臟等組織受到細菌及毒素的損傷，從而嚴重降低生產(chǎn)性能，增加死亡的概率[25]。本試驗中，凝結芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑制作用為“敏感”（DIZ=14.7 mm）。張韻等[11]檢測凝結芽孢桿菌（菌株編號BC147）對金黃色葡萄球菌的DIZ 為14.5 mm；姚曉紅等[9]和趙鈺等[10]的報道也判定凝結芽孢桿菌對金黃色葡萄球菌的抑菌作用為“敏感”。此外，本研究進一步對比了凝結芽孢桿菌與廣譜抗生素金霉素、土霉素對金黃色葡萄球菌的抑制效果，結果顯示金霉素、土霉素對金黃色葡萄球菌的抑制作用達到“高敏感”，顯著高于凝結芽孢桿菌。以上結果表明，從降低畜禽感染金黃色葡萄球菌的危害而言，飼糧添加凝結芽孢桿菌具有一定的作用，但效果弱于金霉素和土霉素。

3.4 凝結芽孢桿菌對商業(yè)飼用益生菌的抑制作用 我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)范的飼用益生菌有34 種（《飼料添加劑品種目錄》，2013），其中以單一菌或復合菌在飼料及養(yǎng)殖生產(chǎn)中應用較為廣泛的包括芽孢桿菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌）、乳酸菌（屎腸球菌、糞腸球菌）、酵母菌（產(chǎn)朊假絲酵母、釀酒酵母）等[7]。本試驗中，凝結芽孢桿菌對糞腸球菌的抑制作用判定為“不敏感”，與陳桂芳等[26]報道一致；首次發(fā)現(xiàn)凝結芽孢桿菌對產(chǎn)朊假絲酵母沒有抑制作用。以上結果表明，凝結芽孢桿菌與糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母沒有拮抗效應。

本研究顯示，凝結芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌的抑制作用達到“敏感”水平。姚曉紅等[9]用牛津杯法的研究結果顯示，3 株凝結芽孢桿菌（菌株編號B4、BFS-2、NJ）對枯草芽孢桿菌均有一定的抑制作用。趙鈺等[10]也用牛津杯法評估得出凝結芽孢桿菌（菌株編號LL1103）對枯草芽孢桿菌有抑制作用的結論。隨后，F(xiàn)u 等[12]再次證明凝結芽孢桿菌（菌株編號L1208）對枯草芽孢桿菌有抑制作用。然而，劉全永等[27]報道，其篩選的凝結芽孢桿菌（菌株編號LU-B02）對枯草芽孢桿菌沒有抑制作用。筆者推測，以上凝結芽孢桿菌對枯草芽孢桿菌抑制作用結果出現(xiàn)差異主要有兩方面的原因：其一，不同凝結芽孢桿菌菌株的抑菌性能有差異[9]；其二，不同枯草芽孢桿菌的菌株性能差異較大。枯草芽孢桿菌是我國最早、也是當前應用最廣泛的飼用益生菌，因此目前飼料與畜牧行業(yè)應用的商業(yè)飼用枯草芽孢桿菌的菌株繁多，菌株性能差異較大。大量已報道的動物飼養(yǎng)試驗也證明，飼用枯草芽孢桿菌在同一類型動物生長性能上的表現(xiàn)差異巨大[3,28]。

本試驗首次研究了凝結芽孢桿菌對行業(yè)應用較為廣泛的飼用益生菌地衣芽孢桿菌、屎腸球菌的抑制作用，結果顯示凝結芽孢桿菌對地衣芽孢桿菌、屎腸球菌的抑制作用判定為“敏感”。這表明凝結芽孢桿菌與地衣芽孢桿菌、屎腸球菌有一定的拮抗效應。進一步分析顯示廣譜抗菌藥物金霉素、土霉素對地衣芽孢桿菌和屎腸球菌的抑制作用達到“高敏感”，其抑制效果顯著高于凝結芽孢桿菌。這可能是以往我國商業(yè)飼料在普遍含有多種飼用抗生素基礎上，再添加地衣芽孢桿菌、屎腸球菌等飼用益生菌，未能進一步提高畜禽生產(chǎn)性能的主要原因之一[6,29-30]。

以上結果提示，凝結芽孢桿菌與糞腸球菌、產(chǎn)朊假絲酵母沒有拮抗效應，可在商業(yè)飼料及飼料添加劑中復合使用。鑒于凝結芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、屎腸球菌有拮抗效應，在商業(yè)飼料及飼料添加劑中復合使用需謹慎考慮。

4 結 論

本研究結果顯示，凝結芽孢桿菌對豬霍亂沙門氏菌的抑制作用達到“高敏感”，對大腸桿菌K88 和K99、雞白痢沙門氏菌及金黃色葡萄球菌的抑制作用為“敏感”，且對腸道有益菌羅伊氏乳酸桿菌“不敏感”，這從體外抑菌試驗角度驗證了飼糧添加凝結芽孢桿菌具有抑制畜禽腸道有害菌、維持腸道有益菌、平衡腸道菌群的促生長作用。建議商業(yè)復合飼用益生菌要充分考慮凝結芽孢桿菌與其他飼用益生菌菌株之間可能的拮抗效應。

致謝：感謝云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院葛長榮教授對文稿所提的寶貴意見。