雞傳染性喉氣管炎實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)

張雪梅 劉春青

(1，山東省濟(jì)南市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心 250109；2，山東省濟(jì)南市畜牧技術(shù)推廣站 250306）

雞傳染性喉氣管炎（ILT）是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要呼吸道疾病，該病的病原是傳染性喉氣管炎病毒（ILTV）。我國(guó)自20 世紀(jì)50 年代發(fā)現(xiàn)本病，此后在多省份呈現(xiàn)流行性，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，本病及時(shí)確診并采取相應(yīng)的防控手段成為減少經(jīng)濟(jì)損失的關(guān)鍵。對(duì)于雞群是否感染ILTV，根據(jù)臨床癥狀、剖檢變化及流行病學(xué)特征可以做出初步診斷，但由于該病的臨床癥狀和剖檢變化與新城疫、傳染性支氣管炎、禽流感、傳染性鼻炎和支原體病等呼吸道疾病有許多相似之處，易在臨床診斷過(guò)程中發(fā)生混淆，因此，實(shí)驗(yàn)室診斷是確診雞傳染性喉氣管炎必需的。實(shí)驗(yàn)室診斷ILTV 有多種方法，主要包括病毒分離、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子檢測(cè)技術(shù)。

1 病毒分離鑒定

病毒分離是最敏感的病原學(xué)鑒定方法，通過(guò)將病毒接種到9～12 日齡的雞胚絨毛尿囊膜（CAM）上進(jìn)行分離。樣品可以是疑似感染雞的口咽、氣管拭子或病死雞的喉頭、氣管和肺部等樣品。將處理后的樣品接種到CAM 上，感染后48h 可以觀察到痘斑，不同毒株在CAM 形成的痘斑大小和形態(tài)不同，2～12d雞胚就會(huì)死亡，再利用ILT 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清與分離物做雞胚中和試驗(yàn)，當(dāng)陰性血清組和陽(yáng)性血清組的EID50 的對(duì)數(shù)之差大于或等于2.5 時(shí)可判定為ILTV[1]。病毒分離鑒定的方法步驟煩瑣，所需時(shí)間較長(zhǎng)，且需要大量雞胚進(jìn)行試驗(yàn)，已不能滿(mǎn)足快速檢測(cè)的需要。但目前ILTV 的分離主要還是通過(guò)將病料接種到雞胚CAM 和原代細(xì)胞的方法進(jìn)行分離，同時(shí)雞胚還是繁殖ILTV 最常用的方法。

2 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)依靠抗原抗體的特異性結(jié)合，對(duì)樣品中的抗原或抗體進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)技術(shù)。

2.1 瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)使用抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清檢測(cè)樣品中的ILTV 抗體，具有操作簡(jiǎn)便、快速等特點(diǎn)，能將ILT與雞痘、新城疫區(qū)分開(kāi)來(lái)。瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是早期實(shí)驗(yàn)室診斷ILT 的常用手段，但這種方法普遍敏感性較低，且由于性能不穩(wěn)定，目前已無(wú)相應(yīng)產(chǎn)品供應(yīng)。

2.2 血清中和試驗(yàn)

經(jīng)典的中和試驗(yàn)是將抗血清與待檢病毒充分混合，在37℃溫箱中作用1h 后接種8～12 日齡的雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)物，以正常血清加待檢病毒作為對(duì)照組，若抗血清能中和病毒，則判定為ILTV感染。中和試驗(yàn)經(jīng)濟(jì)方便，但某些弱毒株并不能被目前的標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)度抗血清中和，目前中和試驗(yàn)已較少出現(xiàn)在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室診斷中。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

普通ELISA、間接ELISA、抗原捕獲ELISA 等方法都用來(lái)診斷ILT，實(shí)驗(yàn)證明，ELSA 方法比病毒分離、瓊脂凝膠免疫擴(kuò)散試驗(yàn)和中和試驗(yàn)更加敏感、快速和準(zhǔn)確。現(xiàn)在已有商業(yè)ELISA 試劑盒利用抗體檢測(cè)方法診斷ILT，具有較好的敏感性、特異性和重復(fù)性。

3 分子檢測(cè)技術(shù)

ILT 的分子檢測(cè)方法近年來(lái)得到迅速發(fā)展，DNA 分子檢測(cè)技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確的鑒別ILTV，且靈敏度很高，包括傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）等。利用分子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)ILTV 比病毒分離和血清學(xué)檢測(cè)方法更加敏感，而且能在樣本存在其他病原體污染的情況下鑒定出ILTV。

3.1 PCR 技術(shù)

目前，大部分獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)建立起PCR 檢測(cè)方法，應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測(cè)ILTV 操作簡(jiǎn)單、用時(shí)較少，且靈敏度高、特異性強(qiáng)，對(duì)樣品要求不嚴(yán)格，還能在潛伏感染階段檢測(cè)出病毒，是目前使用最廣泛的實(shí)驗(yàn)室診斷手段。應(yīng)用PCR 技術(shù)檢測(cè)ILTV 的DNA，引物序列的選取至關(guān)重要，一般以gB 基因、TK基因的一部分為參考序列，也有選取gC 基因、UL15、ICP4 等保守序列。

3.2 熒光定量PCR 技術(shù)

TaqMan 熒光定量PCR 和SYBR Green 熒光染料PCR 都已經(jīng)被用來(lái)檢測(cè)ILTV，熒光定量PCR 技術(shù)的靈敏度高，最低能檢測(cè)到100 拷貝的病毒，且能定量分析臨床樣本中ILTV 的含量，對(duì)量化區(qū)分ILTV 在雞體不同組織的分布模式，測(cè)定不同時(shí)間感染雞群ILTV 含量有重要意義[2]。

3.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)

LAMP 最先在2000 年被發(fā)明，目前也已被用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)ILTV[3]。相較于其他分子檢測(cè)技術(shù)，利用LAMP 檢測(cè)ILTV 靈敏度高，特異性強(qiáng)、反應(yīng)時(shí)間短，僅需要水浴鍋或恒溫箱，操作簡(jiǎn)單，可通過(guò)肉眼觀察或濁度儀對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，但引物設(shè)計(jì)和篩選難度大，需要針對(duì)靶基因的6 個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4 條特異性引物，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性等。

4 小結(jié)

ILT 是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的重要禽病，本病一旦發(fā)生，僅通過(guò)臨床癥狀和剖檢變化難以確診，快速可靠的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)變得至關(guān)重要。文章總結(jié)了目前常見(jiàn)的ILT 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)，包括病毒分離技術(shù)、血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)和分子檢測(cè)技術(shù)，為不同場(chǎng)景下ILT 的診斷提供了理論依據(jù)，為有效控制該病的發(fā)生及防控提供了技術(shù)支撐。