豬精液常溫保存稀釋粉研究進展

賀巾津，牛統娟，李 宇，張利坤，馮天雨，張 星，張 眉，胡建宏*

(1. 西北農林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100;2. 陜西省畜牧技術推廣總站，陜西 西安 710016)

豬肉在所有肉類消費品中占有非常大的比重，是美食制作及生活中不可或缺的肉類食材，隨著社會的發展人們生活質量得到了不斷的提升，豬肉的消費量也逐漸增加。2017年我國生豬的存欄量占世界生豬存欄量的56.56%，生豬出欄量占比54.45%，豬肉產量占比48.09%；2017年世界豬肉消費量11058×104t，我國豬肉消費量5481×104t，占世界豬肉消費量的49.6%[1]。

人工授精作為現代化養豬生產的重要技術手段，在生豬生產和繁殖中有非常必要和十分突出的作用，是生豬生產的重要保障。當前，人工授精技術在國內已經普及，在我國大約有80%～90%的大型養殖場使用人工授精技術，50%～60%的小型養殖場也在使用人工授精技術[2]。在生產中使用人工授精技術可以減少種公豬的存欄量、減少疾病的傳播和不受時間地點限制來利用優良基因，從而降低生產成本，提高經濟效益。豬精液的保存方法按保存溫度不同分為三種，常溫保存(17～25 ℃)、低溫保存(0～5 ℃)、冷凍保存(-196～-79 ℃)。由于人工授精應用豬冷凍精液會導致母豬受胎率和產仔數降低，在實際生產中主要采用豬精液常溫保存技術。豬精液常溫保存技術的發展使豬精液常溫保存稀釋粉應運而生。

豬精液常溫保存稀釋粉用于配置稀釋液，為精子提供一個適宜其生存并能保存其受精能力、適當pH和滲透壓的環境，保證精子在體外能夠存活較長時間并且結構完整[3]。雖然不同產品之間配方不同，但其成分基本類似，一般包括營養物質、緩沖劑、抗氧化劑、抗菌劑及其他保護成分。本文綜述了豬精液常溫保存稀釋粉中營養物質、緩沖劑、抗菌劑、抗氧化劑、無機鹽離子及其他保護成分的研究進展，目的在于為今后豬精液常溫保存稀釋粉配方的研發提供理論依據，起到參考作用。

1 豬精液常溫保存技術

豬精液的保存根據其保存溫度的不同分為常溫保存、低溫保存和冷凍保存。由于公豬精子膜結構的特殊性使之對低溫特別敏感，容易產生冷應激。豬精液進行冷凍保存后凍融精子的活力不易恢復，且受精能力和受孕率都不高，這限制了冷凍保存精液的使用[4]，所以生產中常常采用常溫保存精液。

豬精液常溫保存是指將稀釋后的精液在15～25 ℃的條件下保存的技術，又稱為室溫保存。常溫保存主要是采用弱酸環境抑制精子活動和代謝，減少能量的消耗，再恢復pH等環境條件又使精子復蘇的原理來達到保存精液的目的。在豬精液常溫保存過程中會受到溫度、滲透壓、pH、稀釋倍數、抗氧化劑、緩沖劑、細菌等多種因素的影響[5]。而隨著保存時間的延長引起精液質量不斷下降的兩大因素就是活性氧和微生物，過量的活性氧會對精子的結構和功能產生損傷，而微生物的滋生會大量消耗精子的營養物質，并增加豬生殖機能降低的風險。目前，豬精液常溫保存稀釋粉種類非常多，但大多數都是美國、丹麥、日本、法國等國外專利產品。為了提高產品競爭力，國內研究者也在不斷努力研制國產稀釋粉產品，研究通過添加抗氧化劑、抗菌劑、中草藥提取物等提高豬精液的保存效果[6]。維生素E、谷氨酰胺、谷胱甘肽、褪黑激素、五味子乙素和牛磺酸等常作為抗氧化成分用于豬精液常溫保存，來減緩氧化應激對精子造成的影響，提高精液保存質量[7]。

2 豬精液常溫保存稀釋粉

一般情況下，稀釋粉配方應該滿足以下要求：首先是在為精子提供營養物質的同時對精子沒有毒副作用；其次是稀釋粉pH、滲透壓要適宜精子存活；最后是稀釋粉的原料成本較低，成分簡單。

常溫保存稀釋粉按保存精液的時間長短分為短效稀釋粉(1～3 d)、中效稀釋粉(4～5 d)和超長效稀釋粉(7～14 d)三種[8]。規模化豬場通常使用短效稀釋粉，因為其成分相對簡單。常見的短效稀釋粉有BTS、Kive和BL-1，其中保存效果和適用性最高的是BTS。中效稀釋粉的種類較多，有效保存精液時間為4～5 d。而長效稀釋粉通常都可以保存5d以上，成分相對于其他兩種要復雜一些，其中Diltec能有效保存精液5～10 d，而力之源則可以有效保存精液長達7～14 d[9]。

2.1 營養物質

精子在常溫保存過程中需要消耗能量來維持其代謝和運動、完成獲能、超活化和頂體反應。精子的代謝活性以及它們在體外保存后利用ATP的能力，決定了精子的能量狀態，體外保存精子的受精能力可能受到可用ATP數量的限制[10]。精子在體外常溫保存時，精子細胞除了消耗自身很少的ATP外，主要通過稀釋液中的糖類來獲取能量，此外稀釋液中的糖類還能夠維持精液滲透壓的動態平衡。常添加的糖類主要有葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、葡聚糖和海藻糖等，而葡萄糖因為價格低廉應用最為廣泛[11]。其中果糖和葡萄糖這樣分子量低的糖可以穿過精子質膜，而像蔗糖、海藻糖和葡聚糖則不能穿過精子質膜，但是其可以和質膜中的磷脂相互作用，從而穩定精子膜蛋白質-脂類復合物，起到保護精子膜的作用，提高精子活率。高建明等[12]研究發現，在豬精液常溫保存稀釋液中添加1.5 g/L海藻糖可以提高精液保存效果。潘紅梅等[13]研究發現，用66.7%的蔗糖與33.3%的乳糖組合添加，精子活力達37.0%，顯著高于其它各組，說明在稀釋液中添加乳糖能夠提高豬精子活力。因此，在豬精液常溫稀釋粉配方中，營養物質至關重要，它能夠為精子的代謝及其運動提供能量，保障精子能夠完成受精。

2.2 緩沖劑

新鮮豬精液的pH為7.2～7.5，若是pH低于這個范圍，將會對精子活力產生較大的影響。弱酸性環境更適宜精子的生存，更有利于精液的常溫保存，能夠提高精液的常溫保存效果。精子的主要代謝途徑是糖酵解，在代謝過程中會產生乳酸等酸性物質降低環境中的pH[7]。過多酸性物質的積累會導致精子代謝過程減慢甚至出現精子酸中毒死亡現象[14]。在精液常溫保存過程中，為了保持其內環境的相對穩定，添加適量的緩沖劑變得非常必要[15]。目前常用的緩沖劑主要有檸檬酸鈉、碳酸氫鈉、HEPES、MOPS、TES和Tris等。鮮紅等[16]研究發現，Tris的緩沖效果要優于NaHCO3-檸檬酸鈉體系，Tris作為緩沖劑可以顯著增加精液常溫保存的時間。由此可見，在豬精液常溫稀釋液中添加一定量的緩沖劑可以維持精子細胞外環境的相對穩定，增加精液常溫保存的時間，從而提高精液保存效果。

2.3 抗菌劑

在豬精液常溫保存過程中，適宜的溫度、pH、滲透壓和營養物質等環境容易引起細菌微生物的滋生，對精液保存質量造成不良影響。大量滋生的細菌微生物會與精子爭奪稀釋液中的營養成分，而細菌微生物的代謝產物會對精子的生存造成危害，導致精子細胞死亡。Althouse等[17]研究發現細菌體內的凝集因子會使得精子發生凝集效應，改變精液稀釋液的滲透壓，造成精子頂體腫脹破損，精子進行無氧發酵產生酸性物質，使精液稀釋液的pH下降，嚴重影響到精液的保存時間和質量。常見的細菌有沙門菌、變形桿菌、大腸桿菌、棒狀桿菌、葡萄球菌、鏈球菌等。

豬精液中的細菌污染源主要分為動物源和非動物源兩種。因此，在采集精液和處理精液時加強衛生管理，可以減少非動物源的細菌污染；同時也可以加入抗生素來抑制細菌微生物的生長繁殖[18]。在豬精液常溫保存中，為了提高精液保存質量，通常會添加合適濃度的抗生素對細菌微生物的生長繁殖進行抑制。添加抗生素可以有效抑制細菌的繁殖，能夠有效增加精液保存的時間，提高母豬受胎率[19]。慶大霉素在豬精液稀釋液BTS中的標準添加量為0.25 g/L。劉兆軍[20]研究表明，在BTS中添加0.2 g/L的雙乙酸鈉替代40%的慶大霉素，可以起到和標準添加量相同的保存效果。

隨著抗生素的廣泛應用，越來越多的研究發現豬精液中常見的一些細菌已經出現了耐藥性，而且一些喹諾酮類抗生素由于存在食品安全問題已被國家農業部禁用。所以，研發新型的抗生素替代物變得至關重要。抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)作為一種具有廣譜抗菌性的天然物質，受到廣泛的關注。Puigtimonet等[21]研究發現，在豬精液稀釋液中添加3 μM的兩種抗菌肽，豬β防御素-1(PBD1)和豬β防御素-2(PBD2)，可以抑制一部分細菌的生長。雖然AMPs具有廣譜、快速的殺菌活性以及低耐藥性，但研究發現一些特定的AMPs對精子細胞有毒害作用[19]。因此，人們在尋找更多的新型抗生素替代物，希望能夠替代抗生素廣泛應用在豬精液常溫保存中。王健[22]研究表明，稀釋液中添加80 μM的蛋氨酸碘能夠顯著抑制變形桿菌屬、葡萄球菌屬以及假單胞菌的生長繁殖，從而改善了公豬精子的活力和質膜完整性，提高了豬精液常溫保存效果。魏寧等[23]研究發現，在豬精液稀釋液中添加0.16 g/L的ε-聚賴氨酸最多可替代75%標準添加量的慶大霉素。溶菌酶是一種抗菌物質，能夠直接作用于細菌的細胞壁起抑菌作用。鄧昌海[24]研究發現，在稀釋液中添加2.0 mg/mL的溶菌酶在豬精液常溫稀釋液中能顯著提高精液的活力以及質膜頂體完整率。因此，在豬精液常溫稀釋液中添加合適濃度的抗生素類替代物的抗菌劑能夠提高精液保存質量，同時又不會使細菌產生耐藥性，有助于加強畜產品生物安全。

2.4 抗氧化劑

在正常生理情況下，精液具有一定的抗氧化能力。精子在代謝過程中會產生一定量的活性氧(Reactive oxygen species，ROS)。合適水平的ROS對精子結構以及功能的成熟等有一定的有利作用[25]，同時對維持精子體內穩態、精子發生細胞的生長、精子的獲能、增加頂體反應發生率等具有促進作用[26]。當精子中積累的ROS超出了精子自身的抗氧化能力后，會對精液的質量造成不良影響，這是因為公豬精子比較特殊，精子質膜中不飽和脂肪酸、磷脂酞乙醇胺和鞘氨醇較高，這些脂類極易受到ROS的攻擊而產生脂質過氧化物丙二醛等，使精子產生氧化應激反應，從而對精子產生毒害作用，造成精子質膜、頂體、線粒體損傷[27]。而抗氧化劑能夠有效的抑制或者減緩自由基的產生，從而調節精子細胞氧化還原平衡，減少氧化應激反應的發生，降低精子細胞受到的氧化損傷。因此，為了降低ROS對精子的氧化損傷，在稀釋粉中添加抗氧化劑成為保護精子在保存過程中免受氧化應激的有效方法。

抗氧化劑主要包括酶類和非酶類抗氧化劑。酶類抗氧化劑包括谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽還原酶(GR)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶等。谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶能夠通過將過氧化氫還原成水分子來清除過氧化氫從而起到抗氧化作用。非酶類抗氧化劑主要有α-硫辛酸、褪黑素、谷胱甘肽、類胡蘿卜素、維生素類、銅、鋅、硒等。谷胱甘肽是一種強的抗氧化劑，谷胱甘肽分子中的巰基容易被氧化脫氫，從而將細胞內的過氧化氫還原成水，清除細胞內自由基，減少自由基對細胞造成的氧化損傷。褪黑激素(Melatonin )是一種有很強抗氧化性能的內源性抗氧化劑，能夠有效清除細胞中自由基，減少氧化損傷。維生素E作為親脂性抗氧化劑，帶有過氧化氫自由基清除基團(LOO)，能夠保護精子質膜中多不飽和脂肪酸免受過氧化損傷。

Ajina等[29]研究表明，維生素E和鋅都能起到一定的抗氧化作用，能夠提高精子的活率。何蘭花等[30]研究發現，添加維生素E的豬精液常溫保存稀釋液能夠有效提高精子活率，從而改善精液品質。朱林煒[11]研究發現，在BTS中添加1 mmol/L的GSH精子活率最高0.753，添加200 IU/mL SOD精子活率最高(0.683±0.006)，兩者都能夠增強豬精液常溫保存的效果。在豬精液常溫稀釋液中添加0.5 μmol/L蝦青素，能夠提高精子的活力[31]。所以，在豬精液常溫稀釋液中添加合適濃度的抗氧化劑能夠顯著提高精液保存質量，延長保存時間，從而提高精液保存效果。

2.5 無機鹽離子

在豬精清中含有Na+、K+、Ca2+、Mg2-、Cl-、P043-以及HCO3-等無機離子。K+有利于維持精子的運動能力；而過量的HCO3-會導致腺普酸環化酶的異常活化，從而誘導精子提前獲能，不利于精液在體外常溫保存；同樣當Ca2+濃度過高時，也會導致精子的提前獲能和頂體反應，影響精液品質[32]。六價鉻是一種廣泛存在的重金屬離子，精液中的六價鉻會使精子受到氧化應激損傷。所以，在配制常溫稀釋液時應該使用去離子水，同時為了維持稀釋液pH和滲透壓的動態平衡，稀釋液配方中的無機鹽離子種類和添加濃度都應該嚴格控制。同時，為了避免Cu2+和六價鉻等有害金屬離子對精子造成損傷，通常會在稀釋液中加入適量具有鰲合作用的EDTA[33]。所以，在豬精液常溫稀釋液中添加合適種類、適宜濃度的無機鹽離子能夠維持稀釋液的pH和滲透壓動態平衡，可以適當延長豬精液體外保存時間，有效提高精液保存質量。

2.6 其他保護劑

牛血清白蛋白(BSA)是一種蛋白類保護劑，通過中和精子產生的有害代謝物從而穩定精子的結構，維持精子運動狀態和減少精子凝集，從而對精子起保護作用，BSA是一種良好的精子保護劑[34]。Shannon等[35]研究發現，牛血清白蛋白有利于維持精液-稀釋液體系膠體的滲透壓平衡，同時能夠提高精子質膜和頂體完整性。在不同劑量BSA對豬精液常溫保存效果的研究中發現，添加4 g/L BSA的稀釋液的精子活率顯著高于其他組[36]。此外，也有研究發現添加適量的脫脂奶粉可以有效改善豬精液常溫保存效果[37]。劉琦[34]研究了四種氨基酸類保護劑三七皂甙R1、L-谷氨酞胺(Gln)、牛磺酸(Tau)和中藥活性成分五味子乙素(Sch B)對豬精液常溫保存效果的影響，發現添加5 mmol/L的三七皂甙R1、4 mmol/L的Gln、5 mmol/L的Tau以及15 μmol/L的Sch B可以顯著提高精子活率0.69，0.70，0.70，0.71，提高精液常溫保存效果。因此，在豬精液常溫稀釋液中添加適量的牛血清白蛋白、脫脂奶粉等其他保護劑，能夠有效改善豬精液常溫保存效果。

3 展 望

隨著我國現代化養豬業發展越來越迅速，人工授精技術的普及率也越來越高，所以研發出保存效果更好的豬精液常溫保存稀釋粉變得迫在眉睫。目前，市面上有許多新開發的添加劑在豬精液常溫保存稀釋粉中應用，但是它們的最佳添加量及其作用的機理還有待進一步的研究。而這些新型添加劑的研發和應用對進一步完善豬精液常溫保存技術起著重要作用，對推進我國養豬業集約化發展有著重大意義。