嗜乳脂蛋白基因在肺腺癌中的功能及預后作用：多組學融合與生存分析

齊 鑫，陳圣倫，左嘉晨，閆東輝，陳佳佳

（蘇州科技大學化學與生命科學學院 江蘇 蘇州 215011）

肺癌是呼吸系統最常見的惡性腫瘤，在世界范圍內其發病率和死亡率分別位居惡性腫瘤的第二位和第一位。2020 年全球癌癥統計數據顯示，全球每年肺癌患者新增約220.6 萬例，死亡約179.6 萬例，已嚴重威脅人類的生命和健康[1]。肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）是最常見的肺癌組織學亞型，約占肺癌患者總數的40%[2]。雖然，近年來診斷和治療肺腺癌的技術手段取得了不斷的創新和發展，但是肺腺癌仍然是世界范圍內癌癥患者死亡的主要原因之一，患者的5 年生存率仍較低。目前，肺腺癌個體患者的治療決策主要基于TNM 分期和分化等級等特異性因素，但是由于不同個體間有高度的異質性，具有相同病理條件的患者通常在治療反應和預后方面表現出巨大的差異，限制了傳統方法在預測肺腺癌患者預后方面的應用。因此，迫切需要篩選鑒定可靠的預后生物標志物，為肺腺癌患者的風險分層和臨床治療提供指導。

嗜乳脂蛋白（butyrophilins, BTNs）是與B7 蛋白家族具有相似結構的免疫球蛋白家族。1981 年，BTN 最初于泌乳上皮細胞中被發現并構成乳蛋白，與泌乳過程密切相關。隨著研究的深入，越來越多的研究表明BTNs 在免疫調節中發揮重要作用。迄今為止，已發現人類BTN 超家族包括7 個BTN基 因（BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN2A3、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3）、5 個BTN 樣基因（BTNL2、 BTNL3、 BTNL8、 BTNL9、 BTNL10）和1 個SKINT 樣因子（SKINTL）[3]。最新研究顯示，BTNs 是癌癥免疫治療的潛在治療靶點，靶向BTNs有助于激活抗腫瘤的免疫反應，目前通過靶向BTNs 增強Vγ9Vδ2+ T 細胞激活的抗體正在在臨床試驗中進行測試[4]。但是，BTNs 基因在肺腺癌進展過程中的作用及其作為肺腺癌預后生物標志物的潛能尚未明確。

本研究基于生物信息學方法，分析了BTN 基因家族在肺腺癌腫瘤和正常對照組織中的表達水平，鑒定了與肺腺癌進展密切相關的BTN 基因家族 成 員BTN2A2 和BTNL9， 并 對BTN2A2 和BTNL9 表達水平與肺腺癌患者預后的相關性進行了評估。同時分析了BTN2A2 和BTNL9 表達水平與免疫細胞浸潤的相關性，揭示了肺腺癌中BTN2A2和BTNL9 共表達基因顯著富集的生物過程。

1 材料與方法

1.1 基因差異表達分析

利用UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/）在線工具[5]分析BTN 家族基因在肺腺癌腫瘤和正常對照組織的表達情況，分析類型選擇“TCGA Gene analysis”，TCGA 數據集選擇“lung adenocarcinoma”，得到目的基因在肺腺癌腫瘤和正常對照組織中表達水平的箱線圖，并進行統計學分析，P＜0.05被認為統計學差異顯著。

1.2 基因表達水平與肺腺癌進展的相關性分析

為了分析BTN 家族基因的表達水平與肺腺癌進展的相關性，利用GEPIA2（http://gepia2.cancerpku.cn/#index）在線分析工具[6]中的“Expression Analysis”模塊，分析目的基因在肺腺癌階段Ⅰ、階段Ⅱ、階段Ⅲ和階段Ⅳ的表達水平有無顯著的變化。使用單因素方差分析（one-way ANOVA）評估基因差異表達的顯著性，P＜0.05 被認為統計學差異顯著。

1.3 Kaplan-Meier 生存曲線分析

分別利用Kaplan-Meier plotter 數據庫（https://kmplot.com/analysis/）[7]、PrognoScan 數 據 庫（http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/）[8]和GEPIA2 數據庫繪制肺腺癌中BTN2A2 和BTNL9 的Kaplan-Meier 生存曲線，使用基因表達的中位數將相應數據集中的患者分為高表達組和低表達組。使用對數秩檢驗（log-rank test）進行統計學檢驗，P＜0.05 被認為具有統計學意義。

1.4 免疫細胞浸潤分析

利 用 GEPIA2021 （http://gepia2021.cancer-pku.cn/）數據庫的“Cell Type Proportion Analysis”模塊，數據集選擇TCGA 數據庫中的“LUAD Tumor”和“LUAD Normal”，“Select deconvolution tool”參數選擇“quanTIseq”，“Normalization”參數選擇“True”，對肺腺癌腫瘤和正常對照組織中免疫細胞組分的變化進行分析，P＜0.05 被認為具有統計學意義。進一步，利用TIMMER2.0 數據庫（http://timer.cistrome.org/）[9]分析BTN2A2 或BTNL9 與免疫細胞浸潤水平的相關性，P＜0.05 被認為具有統計學意義。

1.5 蛋白質相互作用分析

利用 Cytoscape（3.6.1）軟件[10]中的GeneMANIA[11]插件對與BTN2A2 和BTNL9 互作的蛋白進行分析，篩選前20 個蛋白構建蛋白質相互作用網絡。

1.6 功能富集分析

為了研究BTN2A2 和BTNL9 在肺腺癌中的功能，首先利用cBioPortal（https://www.cbioportal.org/）數據庫，以|Spearman’s correlation|≥0.5 和q value＜0.05 作為篩選標準，分別鑒定與BTN2A2 和BTNL9 在肺腺癌中共表達的基因。然后，利用“ClusterProfiler”R 包分別對與BTN2A2 和BTNL9共表達的基因進行GO 功能富集分析。調整后的P＜0.05 被認為具有統計學意義。

2 實驗結果

2.1 BTNs 在肺腺癌和正常對照組織中的表達情況

首先，在Ensembl 數據庫（https://asia.ensembl.org/index.html）檢索人類BTN 基因家族（13 個基因）的注釋信息和序列信息，發現已報道的人類BTN 超家族中的BTN2A3、BTNL10 和SKINTL不能編碼蛋白質。進一步，利用UALCAN 在線工具，對編碼蛋白質的BTN1A1、BTN2A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、BTNL2、BTNL3、BTNL8、BTNL9 基因在癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas, TCGA）數據庫肺腺癌腫瘤和正常對照組織中的表達水平進行分析。結果顯示，BTN1A1在肺腺癌腫瘤組織中顯著上調表達（P＜0.05）且其在腫瘤和正常對照組織中的表達量均較低；BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、BTNL3、BTNL8、BTNL9 均在肺腺癌腫瘤組織中顯著下調表達（P＜0.05）；BTN2A1 與BTNL2 在肺腺癌腫瘤和正常對照組織中的表達水平無顯著差異（P＞ 0.05），如圖1所示。該結果提示BTN 超家族在肺腺癌的致病過程中可能發揮著重要的作用。

圖1 BTN 家族基因在肺腺癌腫瘤和正常對照組織的表達水平

2.2 BTNs 與肺癌進展的相關性

利用GEPIA2 在線工具，對在肺腺癌腫瘤和正常對照組織中顯著差異表達的8 個BTNs 基因（BTN1A1、BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、BTNL3、BTNL8 和BTNL9）與肺腺癌不同病理階段（stage Ⅰ、stage Ⅱ、stage Ⅲ和stage Ⅳ）進展的相關性進行了分析。結果顯示，這8 個基因中，只有BTN2A2 和BTNL9 分別與肺腺癌的進展顯著相關（P＜0.05），如圖2 所示，提示嗜乳脂蛋白基因BTN2A2和BTNL9 在肺腺癌發生發展過程中的潛在作用。

圖2 表達水平與肺腺癌病理階段的相關性

2.3 BTNs 表達水平與肺腺癌患者預后的相關性

Kaplan-Meier 生存曲線能夠反映基因表達與癌癥患者預后的相關性。在本研究中，首先利用Kaplan-Meier plotter 數據庫，對與肺腺癌進展密切相關的嗜乳脂蛋白基因BTN2A2 和BTNL9 與肺腺癌患者總體生存時間的相關性進行了分析。結果顯示，與高表達BTN2A2 組相比，低表達BTN2A2 組患者的總生存率顯著降低（P＜ 0.05）；與高表達BTNL9組相比，低表達BTNL9 患者的總生存率也顯著降低（P＜ 0.05），如圖3 所示。為了進一步證實BTN2A2和BTNL9 與肺腺癌患者預后的相關性，分別使用PrognoScan 和GEPIA2 數據庫，進行Kaplan-Meier生存曲線分析。結果顯示，來自PrognoScan 和GEPIA2 數據庫的結果與Kaplan-Meier plotter 數據庫的結果一致，BTN2A2 和BTNL9 分別與肺腺癌患者總體生存時間具有顯著的相關性，如圖4、圖5所示。為了更深入的研究BTN2A2 和BTNL9 分別與肺腺癌患者預后的相關性，進一步將Kaplan-Meier plotter 數據庫中的肺腺癌患者根據性別和吸煙史分為女性、男性、吸煙和不吸煙4 組，生存曲線分析結果顯示，BTN2A2 和BTNL9 與肺腺癌患者預后的相關性與性別無關，即BTN2A2/BTNL9的低表達與女性、男性肺腺癌患者的預后差均顯著相關（P＜ 0.05），如圖6、圖7 所示；同時，BTN2A2和BTNL9 與肺腺癌患者預后的相關性與吸煙史有關，即BTN2A2/BTNL9 的低表達與吸煙肺腺癌患者的預后差顯著相關（P＜ 0.05），如圖8 所示，而與不吸煙肺腺癌患者的預后差無顯著相關性（P＞ 0.05）。

圖3 Kaplan-Meier plotter 數據庫中肺腺癌患者總體生存期的Kaplan-Meier 生存曲線分析

圖4 PrognoScan 數據庫中肺腺癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線分析

圖5 GEPIA2 數據庫中肺腺癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線分析

圖6 Kaplan-Meier plotter 數據庫中女性肺腺癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線分析

圖7 Kaplan-Meier plotter 數據庫中男性性肺腺癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線分析

圖8 Kaplan-Meier plotter 數據庫中吸煙肺腺癌患者的Kaplan-Meier 生存曲線分析

2.4 BTNs 表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

基于BTNs 基因家族在免疫調節中的重要作用，對BTN2A2 和BTNL9 表達水平與免疫細胞浸潤的相關性進行了探究。首先，利用GEPIA2021數據庫，對肺腺癌中免疫細胞組分的變化進行了分析。結果顯示，B 細胞、巨噬細胞M1、巨噬細胞M2、CD8+T 細胞和調節性T 細胞在肺腺癌腫瘤和正常對照組織中的細胞比例均具有顯著的差異，如圖9 所示。進一步，利用TIMMER2.0 數據庫分析BTN2A2 和BTNL9 表達水平與這5 種免疫細胞浸潤的相關性進行分析，發現BTN2A2 的表達水平與這5 種免疫細胞的浸潤顯著正相關，如圖10 所示。BTNL9 的表達水平與B 細胞、巨噬細胞M2 和調節性T 細胞的浸潤顯著正相關，如圖11所示，表明BTN2A2 和BTNL9 在免疫浸潤過程中的關鍵作用。

圖9 免疫細胞在肺腺癌腫瘤和正常對照組織中的比例

圖10 BTN2A2 表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

圖11 BTNL9 表達水平與免疫細胞浸潤的相關性

2.5 與BTN2A2 和BTNL9 相互作用的蛋白質

基于蛋白質相互作用對基因功能的影響，利用Cytoscape 中GeneMANIA 插件對與BTN2A2 和BTNL9 相互作用的蛋白質進行分析并構建由互作關系最強的前20 個蛋白質組成的蛋白質相互作用網絡。蛋白質之間的相互作用主要通過物理相互作用、共享蛋白質結構域、共表達和共定位4 個方面體現。結果顯示，參與該互作網絡的蛋白功能均與免疫調節密切相關，如圖12 所示。如BTN2A1 可作為一種針對Vγ9Vδ2 T 細胞對惡性細胞毒性的免疫檢查點[12]，BTN3A1、BTN3A2 與BTN3A3 在γδ T 細胞的調節過程中發揮著關鍵的作用[13]，BTN3A1能夠調控Vγ9Vδ2 T 細胞的激活[14]，BTNL3 能夠直接結合Vγ4+T 細胞受體[15]，BTNL8 能夠共刺激初級免疫反應[16]，DOK2 是T 細胞受體信號通路的負調控因子[17]，DAPP1 能夠參與調節MHC I 類誘導的CD8+ T 細胞的活化[18]，ERMAP是一種B7 家族相關分子，負調控T 細胞和巨噬細胞反應[19]。因此，通過蛋白質相互作用網絡分析，可以推測BTN2A2 和BTNL9 可能通過免疫調節影響肺腺癌的致病過程。

圖12 由BTN2A2、BTNL9 及其互作蛋白組成的蛋白質相互作用網絡

2.6 BTN2A2 和BTNL9 共表達基因的功能

為了進一步揭示BTN2A2 和BTNL9 在肺腺癌中的功能，本研究首先利用cBioPortal（https://www.cbioportal.org/）數據庫對在肺腺癌中分別與BTN2A2和BTNL9 共表達的基因進行鑒定，然后利用“ClusterProfiler”R 包分別對與BTN2A2 和BTNL9共表達的基因進行GO 功能富集分析。結果顯示，與BTN2A2 共表達的基因在T 細胞激活調控、淋巴細胞激活調控等生物過程和細胞因子結合、MHC 蛋白復合體結合等分子功能條目中顯著富集，如圖13a 所示；與BTNL9 共表達的基因在與細胞周期、DNA 復制相關的生物過程和分子功能條目中顯著富集（adjust.P＜0.05），如圖13b 所示。

圖13 BTN2A2 或BTNL9 共同表達基因的GO 功能富集分析

3 結 束 語

肺腺癌是肺癌中最常見的亞型，盡管其治療技術手段不斷改進，但是患者5 年總生存率仍較低，是世界范圍內癌癥患者死亡的主要原因之一。最新研究顯示，BTN 家族基因在免疫調節中發揮重要作用，可作為癌癥免疫治療的潛在治療靶點，但是其在預測肺腺癌患者預后方面的研究仍較少。生物標志物能夠可靠地評估疾病預后和患者生存期，對指導肺腺癌的臨床治療具有重要價值[20]。本研究旨在利用生物信息學的軟件和方法對BTN 家族基因作為肺腺癌預后生物標志物的潛能進行探究，進而為肺腺癌患者的個性化治療提供指導。

近年來，高通量測序技術的發展促進癌癥相關分子標志物的鑒定和表征。本研究基于TCGA 數據庫中的肺腺癌數據，通過整合分析發現，編碼蛋白質的10 個人類BTN 基因中，有7 個基因（BTN2A2、BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3、BTNL3、BTNL8、BTNL9）在肺腺癌腫瘤組織中顯著下調表達（P＜0.05），提示BTN 基因在肺腺癌中的重要作用。進一步分析發現，BTN2A2 和BTNL9 分別與肺腺癌發展和預后密切相關，均可作為獨立的預后因子，表明BTN2A2 和BTNL9 具有作為預測肺腺癌患者生存時間生物標志物的潛力。通過免疫浸潤分析發現，BTN2A2 的表達水平與B 細胞、巨噬細胞M1、巨噬細胞M2、CD8+ T 細胞和調節性T 細胞的浸潤水平呈正相關，BTN2A2 的表達水平與B細胞、巨噬細胞M2 和調節性T 細胞的浸潤水平呈正相關，提示BTN2A2 和BTNL9 在肺腺癌致病過程可能參與了免疫調節。蛋白質相互作用網絡分析結果也顯示，與BTN2A2 和BTNL9 互作的蛋白均參與調控免疫反應。最新研究顯示，與BTN2A2和BTNL9 互作的部分蛋白能夠指示肺癌患者的預后情況或參與調控肺癌的進展。如BTN3A3 表達降低能夠反映非小細胞肺癌患者的預后不良，且能夠促進非小細胞肺癌細胞增殖、遷移和侵襲[21]；ADGRF4可調控非小細胞肺癌細胞的侵襲性[22]；DOK2 能夠抑制EGFR 突變的肺腺癌[23]等。另外，BTN2A2和BTNL9 共表達基因的GO 功能富集分析結果顯示，BTN2A2 主要參與T 細胞激活調控、淋巴細胞激活等生物過程，而BTNL9 主要參與細胞周期、DNA 復制相關的生物過程，提示BTN2A2 和BTNL9可能在肺腺癌的發生發展過程中發揮著不同的重要功能。

綜上，本文通過利用生物信息學的方法進行綜合分析發現，BTN 家族的BTN2A2 和BTNL9 均具有作為肺腺癌患者預后生物標志物的潛力，并可能通過免疫調節影響肺腺癌的進展過程，但是具體的作用機制需要進一步的功能實驗進行解析。本研究結果可為鑒定肺腺癌的預后生物標志物提供線索，進而指導患者的精準臨床治療。