異丙腎上腺素通過誘導心肌線粒體氧化應激在小鼠心律失常中的作用

劉 婷，羅 弦，劉 竹，許丹迪，劉蕾穎，譚曉秋，李 濤

1.西南醫科大學心血管醫學研究所（瀘州646000）；2.西南醫科大學四川省心血管疾病防治協同創新中心（瀘州 646000）

心律失常是臨床上常見且復雜的心血管疾病，并隨年齡增加發病率增高。心律失常容易合并或繼發心力衰竭、心肌肥大、心肌缺血等心血管疾病，最終導致患者暈厥、心臟驟停，甚至心源性猝死[1]。臨床上按心律失常發作時心率的快慢分為快速性和緩慢性心律失常兩大類，前者常見于過早搏動、心動過速、心房顫動和心室顫動等；后者常見于竇性緩慢性心律失常和各種傳導阻滯等。目前心律失常的治療仍然是臨床上的一大難題，發生發展過程中存在復雜的電生理與結構重構改變，這是因為對心律失常疾病的發生發展機制認知還存在嚴重不足。研究證明，心肌細胞的氧化應激與心律失常的發生密切相關[2]。因此，探索心臟氧化應激的調控機制，有助于探討心律失常的發生機制及尋找新的干預靶點，對于預防和治療心律失常具有重要的理論基礎和臨床意義。

氧化應激是指機體內氧化與抗氧化作用失衡，產生大量氧化中間產物。氧化應激是自由基在體內堆積的一種負面反應，被認為是導致疾病的一個重要因素[3]。目前越來越多的證據顯示，氧化應激參與多種心血管疾病的發生和發展過程。

異丙腎上腺素（isoprenaline，ISO）是合成的兒茶酚胺，屬于非選擇性的β受體激動劑，在心血管功能的調控中發揮重要作用[4]。但是，ISO 對心肌組織氧化應激的研究不全面。本研究通過觀察ISO 對線粒體相關指標的影響，評估ISO 在線粒體通路中影響氧化應激的調控，進一步探討ISO 對小鼠心肌氧化應激的作用機制，為臨床應用提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 動物

C57 雄鼠由西南醫科大學動物中心提供，20～22 g，所有的動物操作符合西南醫科大學動物實驗倫理要求（201903-259）。小鼠腹腔注射ISO，劑量為10 mg/kg。

1.2 心電圖記錄

將小鼠放進氣體麻醉盒里，異氟烷麻醉后，小鼠仰臥位固定。將電極一端插入小鼠四肢末端的皮下，另一端與心電換能器相連接；右上肢為I導聯、左上肢為Ⅱ導聯、右下肢為III導聯、左下肢為AVF導聯；AcqKnowledge 4.4 軟件采集小鼠心電數據，記錄注射ISO 前后的心電圖。接下來對小鼠進行程序性電刺激pacing起搏，對小鼠行氣管插管，并接上小動物呼吸機。開胸后暴露心臟，并在小鼠左心室位置安放刺激電極，調整電子刺激器（Nihon Kohden Corporation），開始Pacing 并使用AcqKnowledge 4.4 軟件采集數據和記錄Pacing起搏后的心電圖及誘發的室性心律失常（ventricular tachycardia，VT）情況[5]。

1.3 光標測

將小鼠頸椎脫臼法處死后，取出心臟，將主動脈固定在Langendorff灌流系統。先用PSS心臟灌流10 min 后，再用10 μM 的停搏劑Blebbistatin 灌流大約10 min，觀察到離體心臟停止舒縮活動。取1μM 的RH237 電壓敏感染料循環灌注染色10 min 后，繼續循環灌注停搏劑。

使用Spik2軟件編輯所需刺激方案，電刺激調整至5 V。刺激波寬2 ms，刺激頻率為10 Hz。使用Meta Morph 軟件設置信號采集參數曝光時間為0.9 ms，像素面積為32×32 μm。調整激發波長為525 nm 的LED 燈，使其聚焦于心臟上。心尖部進行電刺激，同時打開激發光源，開始信號采集。信號記錄采集結束后，給予1 μM ISO灌流1 min后，重復上述的刺激方案和記錄信號[6-7]。

1.4 取材

小鼠隨機分為未注射組（CON 組）和腹腔注射組（ISO組），快速解剖取心臟，用預冷的PBS液清洗殘留血液，濾紙拭干稱重，將心肌組織剪碎，轉移到玻璃研磨器，按1∶10 比例加入預冷的PBS 液，用玻璃研磨器進行勻漿。將勻漿后組織分成三份進行線粒體指標的檢測。

1.5 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測

按照試劑盒說明書（英濰捷基，C10444），將100μL 的勻漿液4 ℃，5 000 rmp 離心5 min，棄上清。沉淀中加入240μL PBS 重懸混勻，再加入60μL ROS熒光染料，混勻，37 ℃避光孵育30 min。4 ℃，5 000 rmp離心5 min后，棄上清。用PBS洗滌三次，去除多余的熒光染料。最終重懸于300μL 的PBS 中，將懸液加入96 孔板中，每孔100μL，立即用酶標儀檢測熒光強度。

1.6 ATP(ade nosine triphosphate，ATP)檢測

按照試劑盒說明書（英濰捷基，A22066），將200μL 的懸液超聲波破碎2 min，4 ℃，5 000 rmp 離心5 min，取上清進行ATP 檢測，在96 孔板中加入90μL ATP 檢測工作液，10μL 勻漿離心后的上清液，用酶標儀檢測化學發光值。

1.7 線粒體呼吸鏈復合物I檢測

按照試劑盒說明書（南京建成，A089-1-1），在96 孔板中加入156 μL 反應液A，20 μL 反應液B，4μL反應液D，37 ℃孵育3 min后加入20μL勻漿離心后的上清液。用酶標儀檢測OD340 處的吸光值，分別檢測基礎值和反應1 min后的值，根據說明書公式換算復合物的活性單位。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0 軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（）表示，自身對照采用配對t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P ＜0.05 為有統計學差異。

2 結果

2.1 ISO處理后小鼠的心率增快及VT發生率增加

C57小鼠腹腔注射ISO前后相比，注射ISO后的C57 小鼠的心率在短時間內明顯增快，小鼠心率由415.1 ± 28.54 次/min升高到532.8 ± 14.33 次/min，P ＜0.05，有統計學差異，見圖1。在程序性電刺激下，注射ISO后的C57小鼠，室性快速性心律失常的發生率明顯增高，未注射組的VT 發生率為3/22，注射ISO 后小鼠的VT 增加為7/22，P ＜0.05，有統計學差異，見圖2。因此，注射ISO后C57小鼠的心室電穩定性減弱。

圖1 小鼠腹腔注射ISO后的心率變化

圖2 小鼠心臟刺激后，誘發VT的情況

2.2 ISO 通過線粒體途徑影響心肌的氧化應激

與對照組相比，ISO組ROS的熒光強度由2 509±148.2（N=3）升高到3 514±40.88（N=3），P ＜0.01，有統計學差異，表明ISO 組心臟氧化應激程度加重，見圖3A。與對照組相比，ISO 組ATP 化學發光值由65.67±7.688（N=3）降低至22.67±2.728（N=3），P<0.01，有統計學差異，表明ISO 組心肌組織ATP 產量降低，見圖3B。與對照組相比，ISO 組線粒體復合物I 的活性由0.09333± 0.005364（N=3）降低至0.06367±0.004256（N=3），P ＜0.05，有統計學差異，表明線粒體呼吸鏈受到抑制，見圖3C。

圖3 CON組與ISO組線粒體ROS濃度、ATP含量及呼吸鏈復合物I的變化

2.3 ISO引起心臟的動作時程縮短

光標測檢測結果顯示ISO 灌流之后，APD80 時程由30.85±1.880 ms（N=3）縮短至20.65±1.512 ms（N=3），P ＜0.05，有統計學差異，如圖4所示。

圖4 心臟在10Hz刺激下，ISO處理后心電活動的變化

3 討論

異丙腎上腺素是合成的兒茶酚胺，結構上類似于內源性腎上腺素和去甲腎上腺素，具有強烈的非選擇性激動β受體。激動心臟β1受體，可以使心肌收縮力增強、心率加快，收縮期和舒張期縮短。激動β2受體使骨骼肌血管舒張，也有舒張冠狀血管和增加組織血流量的作用。除了激動心臟的β2 受體，還可舒張支氣管平滑肌，并具有抑制組胺等過敏性物質釋放的作用，增加肝糖原、肌糖原分解，增加組織耗氧量。異丙腎上腺素還可以升高血中游離脂肪酸，作用機制與腎上腺素相似，而升高血糖作用較弱。總之，異丙腎上腺素在心血管功能的調控中發揮關鍵作用[8-9]。本研究發現異丙腎上腺素處理之后，不僅小鼠心率增加，還會導致小鼠快速起搏之后，VT 的發生率明顯增加，這也說明小鼠注射異丙腎上腺素后，小鼠的心室電穩定性減低。

急性異丙腎上腺素注射可以引起心肌細胞耗氧量增加，產生大量的自由基，導致氧化應激增加。氧化應激反應不僅可以直接損傷心肌細胞，也能影響線粒體代謝功能，進一步加重心肌損傷[10-11]。線粒體是真核生物重要的細胞器，其主要的功能是參與心肌細胞能量代謝、氧化應激以及程序性細胞死亡過程，其功能障礙與心肌肥厚、心力衰竭的發生和發展密切相關。因此，線粒體對保障心肌細胞的生存和維持心臟正常功能具有重要意義[12-13]。

在健康狀態下，機體的生命活動所需的能量都以ATP 的形式來提供，因此ATP 是機體直接的能量供體。線粒體作為心肌細胞內部的能量工廠，是產生和釋放ATP的場所。活性氧包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。線粒體的能量供應依賴于呼吸鏈復合酶產生的，它們利用電子傳輸過程中釋放的自由能將質子從線粒體基質轉移到間隙，可以促進能量的產生及傳遞[14]。

線粒體氧化應激不僅參與多種生理和病理過程，包括衰老、基因突變、炎癥、糖尿病和神經退行性疾病等，還參與了心臟發育和心臟疾病的發生[15-16]。心臟是終末分化的器官，心肌細胞幾乎沒有復制和再生的潛力。因此，細胞穩態的精確調節和充足的氧供對于心肌細胞的存活和功能至關重要。由于心肌細胞具有較差的再生能力和對氧供的依賴，因此特別容易受到線粒體氧化應激反應的影響。心臟壓力超負荷或心肌缺血會導致心肌細胞氧化應激、能量缺乏、鈣超載和炎癥反應，這些都會破壞線粒體功能并誘發線粒體氧化應激反應。嚴重的線粒體氧化應激反應會導致心臟疾病的發生，動脈粥樣硬化、高血壓、缺血性心肌病、糖尿病性心臟病、心率失常及心力衰竭等心臟疾病的發生發展都與線粒體氧化應激反應密切相關[17-18]。因此，在一定程度上，通過對線粒體氧化應激反應相關通路的干預可以產生對心肌細胞的保護作用[19-22]。

心律失常的發生與氧化應激ROS 產物表達增加有關，降低ROS產物表達的水平可降低心律失常的發生率。其中心房顫動是最常見的快速型的心律失常，有研究發現與正常竇性心律的相比，心房顫動患者心房組織中ROS 相關蛋白的表達上調[23-24]。本研究也證實線粒體氧化應激與心律不齊有關，ROS表達增加可能加速快速心律失常的發展。

本實驗室特聘教授、牛津大學雷鳴博士等最近在《Circulation》上提出，將抗心律失常藥物在原來分類的基礎上進行了補充和完善，未來離子通道上游信號調控是心律失常治療的重要策略之一[25]。本課題關注線粒體功能障礙，從氧化應激反應角度研究其心律失常中的作用，為快速性心律失常的發病機制尋找治療靶點提供新觀點和新思路。

本研究發現，在ISO誘導的氧化應激下，線粒體膜通透性增加，從而導致ATP產生過程受到影響，線粒體呼吸鏈復合物I活性降低，ROS含量增加，這與既往的研究結論是相符的。在本研究中，我們還觀察了ISO 對心臟電活動的影響，發現ISO 可以增加心率，動作電位時程縮短，心臟快速起搏之后，VT的發生率明顯增加。

4 結論

ISO是通過線粒體途徑影響心肌的氧化應激反應，進而增加室性快速性心律失常的發生率，其中具體的分子機制還需要更深入的研究，為臨床預防和治療心血管疾病提供理論依據。