肝細胞肝癌的組學研究進展及在早期診斷中的價值

胡夢圓，付麗云，3

1.寧波大學醫學院（寧波315211）；2.中國科學院大學寧波華美醫院肝病科（寧波315020）；3.浙江省消化系統腫瘤診治及研究重點實驗室（寧波 315020）

1990年至2015年統計數據顯示，原發性肝癌是全球癌癥相關死亡的第四大病因，位居惡性腫瘤發生率第六位[1]。2019 年公布的我國最新惡性腫瘤發病和死亡分析結果顯示：原發性肝癌是我國第四位高發惡性腫瘤，2015 年原發性肝癌發病率和死亡率分別為26.92/10萬和23.72/10萬，位居腫瘤致死病因第二位[2]。肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發性肝癌的主要病理類型，占比約85%～90%[3]。在本篇文章中，肝癌主要指的是HCC這一病理類型。據統計，男性HCC 發病率高于女性，約為3∶1[3]。對于HCC 高危人群的定期篩查，有助于HCC的早期發現、早期診斷和早期治療，是提高HCC 治療療效、提升生存率的關鍵。一項納入47項研究、包含15 158 例患者的Meta 分析顯示：在肝硬化人群中，定期篩查可使早期HCC 的診斷率、HCC 的治愈率和生存率分別提升2 倍以上[4]。因此，HCC 的早篩顯得尤為重要。

目前，組學研究已成為醫學研究領域中常用的技術手段，組學包括基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學和微生物組學等，是研究基因的表達和功能、遺傳產物及代謝產物等的學科。通過組學技術可以將生物體內所有的某分子類型（基因/蛋白質/轉錄產物/代謝產物等）作為對象進行研究，并建立相應數據庫。也可以篩查疾病表達差異分子，進一步研究其與臨床病理特征的聯系，如篩選出HCC癌組織與癌旁組織的差異表達分子[5]。本綜述結合最新研究，主要闡述基因組（genomics）、轉錄組（transcriptomics）、蛋白質組（proteomics）、代謝組（metabolomics）和微生物組（microbiomes）在HCC 中的研究進展和在早期診斷中的運用價值。

1 基因組學

基因組學是一門研究生物體所有遺傳物質的科學，針對單個個體或一類生物體所有基因進行分析和量化，同時研究相互關系及其對生物體的影響[6]。在癌癥研究中，基因組學旨在通過發現和靶向與癌癥相關的基因改變從而推進腫瘤個體化治療[7]。

基因組學應用的技術有：二代測序技術（next-generation sequencing，NGS），又稱高通量測序技術（high-throughput sequencing），包括全外顯子組測序（whole exome sequencing，WES）[8]、全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）[9]、RNA 測序（RNA-SEQ）[10-11]、靶向深度測序（targeted deep sequencing）[8]等，并且仍在不斷擴展新的技術，這些技術通過提供更高的效率和更低的成本推動了科學研究的進展。

WGS 提供了最全面的基因組信息和相關生物學意義，正在成為NGS 中使用最廣泛的應用之一[12]。WES 和靶向測序，通過限制所用基因組材料的大小，可以在一次測序運行中對更多個體樣本進行測序，從而增加基因組研究的廣度和深度[12]。NGS還提供了洞察基因組調控機制的技術基礎，比如蛋白質-DNA 相互作用可以通過免疫共沉淀富集與蛋白質相互作用的DNA 片段來探測[12]。

在HCC 的研究中，基于二代測序技術，以及不斷擴充的各項數據庫，包括癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）計劃和GEO（gene ex?pression omnibus）數據庫等[13]，發現了多個突變基因，其中，TP53 和CTNNB1 是高頻突變的基因[8，14-15]。另外，也發現10 多個基因發生突變，包括AX?IN1、RB1、KEAP1、ARID2、ARID1A、RPS6KA3、APOB、CDKN2A、LRP1B、PTEN、ALB、BRD7、RPL22等[8，16-18]。

基于測序技術的廣泛應用，針對不同變量的更有針對性的基因測序也在不斷開展。近來，針對病因以及流行病學特征開展了一系列基因組學研究。流行病學調查顯示，肝癌最常見的危險因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染和飲食中暴露于黃曲霉毒素B1[14]，同時還發現，男性比女性更易患HCC[14]，蒙古族人是世界上HCC發病率最高的人群之一[15]。針對這些因素，研究的結果如下：HBV相關的HCC：多項組學研究的開展發現了包括端粒酶逆轉錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）在內的癌癥相關基因CCNE1 和MML4 是HCC 中HBV整合的重要靶基因[5，19-21]。TERT 啟動子突變在腫瘤的發生中起到重要作用（見于60%的肝癌）[21]。此外，由于很大比例的HBV相關HCC不包含任何已知癌癥相關基因的整合，因此提出了另外兩種機制：誘導基因組、染色體不穩定性和突變HBV 蛋白的產生、持續表達[22]。另外Péneau 等研究發現，與非腫瘤肝組織相比，在腫瘤肝組織中發現了更多的克隆性HBV 整合，這與2012年的發現一致[10，23]。最新研究顯示，HBV 病毒增強子可誘導癌基因的過表達，值得關注的是，HBV 整合位點基因重排也可能導致癌癥驅動基因的拷貝數改變，HBV 整合的數量是HBV 相關HCC 的獨立預后因素[10]。黃曲霉毒素相關的HCC：黃曲霉毒素相關的HCC 中除了先前報道的常見突變（TP53）外[8]，還發現黏附G蛋白偶聯受體B1基因（adhesion G protein-coupled receptor B1，ADGRB1）高頻突變，與腫瘤組織毛細血管密度增加和程序性死亡因子配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）的表達相關。值得注意的是，在來自中國的肝癌病例中，9.8%含有黃曲霉毒素相關的遺傳特征，與其他含有這些遺傳特征的地區相比肝癌比例要偏大。這些發現可能被用來識別因接觸黃曲霉毒素而患肝癌的患者[24]。地區相關的HCC：蒙古族人的基因圖譜展示了除常見突變（TP53、CTNNB1）外獨特的驅動突變，包括GTF2IRD2B、PNRC2 和SPTA1，其中GTF2IRD2B最為顯著[15]。

依據越來越多的基于流行病學背景的基因圖譜描繪以及隨著新技術的更新以及檢測成本的下降，未來也許可以做到對有高危因素的人群進行基因組的篩查，從而有助于HCC的早期診斷。

雖然全基因組和全外顯子組測序逐漸描繪出HCC 的基因組，但基因改變是如何驅動癌癥表型，目前在很大程度上還不清楚。而接下來介紹的其他組學，也將和基因組學共同研究，為揭示HCC 的分子分型和協助診斷提供幫助。

2 轉錄組學

轉錄組學是研究細胞中基因轉錄情況及轉錄調控規律的學科，即研究各種RNA，是基因組學和蛋白組學的橋梁[11-12]。RNA-seq，是隨著高通量測序技術而發展起來的一種轉錄組測序技術，可對差異基因表達和mRNA 差異剪接進行全轉錄組分析，可用于研究RNA（包括mRNA，非編碼RNA（non-cod?ing RNA，ncRNA）等）生物學的各個層面，包括單細胞基因表達、翻譯和RNA 結構[11]。在RNA-Seq基礎上，微陣列技術（microarray）、批量RNA 測序（bulk RNA-sequencing）、單細胞RNA 測序（sin?gle-cell RNA sequencing，scRNA-seq）、小RNA測序（small RNA sequencing，sRNA-seq）、基因表達芯片（gene expression arrays）等[24-26]為RNA 研究提供了技術支持，孕育出了多個類別的候選標志物。一般研究思路是，首先通過表達圖譜和生物信息學分析，篩選出候選生物標志物，再通過進一步分子、細胞、動物等多層面的實驗，研究這些候選分子的表達水平與臨床參數的關系，以及摸索它們在某一通路中的角色，增加作為潛在的HCC診斷標記物的可行性及尋找治療靶標等。

2.1 微小RNA（microRNA，miRNA）

miRNA 是非編碼RNA 中的一種，許多研究評估了miRNA 能否作為診斷HCC 的潛在生物標志物。比如miR-21 和miR-199[26-27]已被多次驗證是肝癌早期診斷的潛在生物標志物。一項Meta分析表明，4 個miRNAs（miR-20a-5p、miR-320a、miR-324-3p 和miR-375）可以作為HCC 早期診斷生物標志物[28]。另外，一項研究發現miR-375，miR-10a，miR-122和miR-423在HCC組中顯著高于對照組（P ＜0.0 001），并且4-miRNA 組合下的受試者工作特征曲線下面積（AUC）可達到0.995[29]。

2.2 長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）

lncRNA參與HCC細胞的增殖、侵襲、遷移與轉移、細胞凋亡等，在肝癌診斷中具有較好的作用。如，來源于組織、血漿和唾液中的lnc-PCDH9-13：1和來源于血清的lncRNA-UCA1 和 ln?cRNA-WRAP53可以作為診斷HCC潛在的生物標志物。后兩者與AFP 結合可以達到100%的靈敏度[30-31]。由于許多候選早篩標志物lncRNA 在非HCC情況下也會有異常表達，有研究表明lncRNA 與AFP等其他分子聯合診斷效果更佳[32]。

2.3 環狀RNA（circular RNA，cirRNA）

cirRNA是ncRNA的新成員，同樣參與HCC的產生和發展，由于它的不易被核酸外切酶降解的穩定性提示了它有潛力成為早期篩查的標志物[33]。如circRNA-100338、circRNA SMARCA5、hsa_circ_00156、hsa_circ_000224、hsa_circ_000520、hsa_circ_0028502 和hsa_circ_ 0076251 等有潛在的預后和診斷價值[34-37]。

3 蛋白質組學

蛋白質組學主要運用雙向凝膠電泳、色譜與質譜技術，研究組織、體液等來源的蛋白質水平、翻譯后修飾等，能夠將基因型與癌癥表型聯系起來。其中，磷酸蛋白質組學和糖蛋白質組學是兩種有效的功能蛋白質組學方法，可用于挖掘生物標志物以及治療靶點、癌癥發展機制、耐藥機制等[7，38-39]。

蛋白質位于轉錄下游，可以直接反應細胞的活動，并且研究發現，在所有組織中，肝臟分泌的蛋白質數量最多[40]，這使得蛋白組學在HCC中具有較大的價值。

國內樊嘉院士團隊首次利用159 例HBV 相關HCC 患者的成對腫瘤和鄰近肝組織進行蛋白質基因組學表征。發現兩個預后生物標志物PYCR2 和ADH1A；同時發現了CTNNB1和TP53突變相關的信號傳導和代謝特征，其中突變的CTNNB1相關的醛酸磷酸化被證實可促進糖酵解和細胞增殖。該研究提供了一個有價值的資源，極大地擴展了HBV相關HCC的知識，同時也擴展了挖掘早期診斷標志物的思路[18]。

一項前瞻性多中心橫斷面研究，采用毛細管電泳質譜（capillary electrophoresis-mass spectrum，CE-MS）技術檢測HCC 患者的尿蛋白組學特征。鑒定了31個肝癌特異性多肽標志物，并進一步整合到多變量分類模型中。該多肽模型對HCC診斷的敏感度和特異度分別為79.5%和85.1%[38]。這項研究說明了該尿多肽有望成為HCC早期診斷標志物。

4 代謝組學

代謝組學是研究生物個體在置身于某特定環境下所產生的代謝產物集合的科學。代謝物質的起源來自于上游的基因組，能夠與蛋白質組一起直觀且動態地反應細胞的生理病理狀態，是繼基因組學、轉錄組學和蛋白組學之后的又一新方向，是以上組學的補充[41-42]。

對來自KEGG新陳代謝數據庫中注冊的1 434個基因的蛋白質在32個組織中進行了量化，發現肝臟富含的代謝蛋白最多，并且大多數代謝途徑都在肝臟中富集[40]。另外，肝功能下降被認為是肝癌發展的早期事件，因此很可能在血液中觀察到各種代謝紊亂[43]。當HCC 中的癌細胞發生不可控制的增殖時，肝臟代謝可發生復雜的適應性改變，這為找到潛在診斷生物標志物提供了新思路。

Luo等[44]通過多中心大樣本研究發現血清代謝生物標志物組合，包括苯丙氨酰-色氨酸和甘膽酸，對HCC高危人群的早期診斷具有良好的診斷性能。運用液相色譜與質譜聯用技術，Lu 等[45]發現了Pep（36∶4）和Pep（40∶6）可以作為HCC 診斷的潛在血清生物標志物。國內一研究團隊運用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術發現了甘膽酸、2-脫氧栗甾酮、脫氧膽酸甘氨酸偶聯物和牛磺膽酸是潛在早期臨床診斷標志物[46]。基于高分辨率質譜技術，一個前瞻性隊列研究觀察了HCC診斷前的代謝紊亂[43]，確定了與HCC 風險相關的92 種代謝物的循環水平變化，其中14 種具有高可信度，其中一些觀察了長達10 年。14 種代謝物包括：N1-乙酰亞精胺、靛紅、對羥基苯乳酸、酪氨酸、鞘氨醇、L-環（亮氨酰脯氨酰）、甘氨鵝脫氧膽酸、甘氨膽酸和7-甲基鳥嘌呤，與HCC風險呈正相關；視黃醇、硫酸脫氫表雄酮、甘油磷酸膽堿、γ-羧乙基羥色胺和肌酸，與HCC風險呈負相關。Liu等[47]對來自門靜脈血的代謝物的變化進行了代謝組譜分析，發現肝癌患者中的DL-3-苯乳酸、L-色氨酸、甘膽酸和1-甲基煙酰胺的代謝物水平的表達升高，提示了肝功能損害和生存不良。

5 微生物組學

人腸道中有多達100 萬億個微生物，尤其結腸具有最高密度的微生物[48]。肝臟有一個獨特的門靜脈血管系統，該系統接收來自腸道的代謝物并直接輸送到肝臟，另外，還存在膽汁酸的腸-肝循環[49]。因此，來源于腸道的微生物結構的變化可能通過改變代謝物結構成分和代謝物共同來影響HCC 的發生發展[47]。肝臟疾病中的微生物組學研究主要以腸道為背景。腸道微生物組學為尋找HCC非侵入性生物標志物提供了新的思路。

微生物組學使用了元基因組學中的研究方法和技術，來測定樣品中所包含的全部微生物的遺傳物質及群落功能，并研究其與代謝物之間的關系。一般思路是，用二代測序技術和生物信息學工具檢測樣品中提取的DNA 并與微生物基因組的參考數據庫比對，確定細菌分類組成，再通過蛋白質組學和代謝組學的補充，深入研究微生物組的功能[50-51]。

多項研究發現腸道微生物在免疫、炎癥反應以及肝癌發展中具有關鍵作用[52-53]。Behary等[53]發現非酒精性脂肪性肝病相關HCC 的腸道微生物具有獨特的微生物群和代謝組特征，可以調節外周免疫反應。Ponziani 等[54]觀察到與炎癥指標相關的鈣保護素可能受到阿克曼桿菌和雙歧桿菌豐度的影響，這兩種細菌可能通過降低腸道和肝臟的炎癥反應，影響HCC 的發生和進展。也發現了與非HCC 的肝硬化患者相比，HCC 組的類桿菌屬和疣微菌科增加。

成人的微生物群結構具有特異性，但最近的研究表明不同地區的HCC患者雖然微生物結構不同，但HCC中的微生物失調可能存在普遍性，提示了微生物標志物作為早期篩查標志物的可能性[52，55]。任志剛等應用16S rRNA 測序等技術，發現了一種HCC 微生物操作分類單元（operational taxonomy units，OTUs）標志物診斷模型，來自微生物篩選基因的30個OTUS標志物被選為最優標志物集，在識別早期HCC中的AUC為80.64%，并成功地實現了國內西北和華中地區HCC的跨區域驗證，這項研究說明了腸道微生物標志物可以作為HCC 早期診斷的非侵入性潛在工具[52]。然而腸道微生物受到的影響因素很多，不僅來自宿主，還會受環境、飲食等的影響[56-57]，因此仍需大量研究來完善微生物與人體腸道構成的微生態組網絡。

6 展望

基因型與表型的關系一直是生命科學中至關重要的，是破譯生命科學奧秘的鑰匙。對于單基因性狀，可以很容易地理解基因型與表型的關系。然而大多數表型特征涉及多基因產物[41]，若是放到整個人體中，基因與表型則會形成復雜的網絡。組學提供了一種研究技術和方法，篩選出差異基因，再去驗證它與表型是否存在強關聯，再通過后續的功能學研究進行“基因到表型”的探索，為靶向治療和預后提供強大支撐。再通過多組學的整合，有希望繪制出HCC 發生發展中，從基因到轉錄產物，從翻譯產物到直接反應機體狀態的代謝產物，再到與微生物交互作用反應的分子生物學機制全景，最終應用到包括早期診斷在內的多個肝癌研究領域。

多組學研究發現的候選早篩生物標志物距離高特異性、高敏感性、可重復性、低成本性的理想腫瘤標志物相差很遠[58]。未來的挑戰包括大規模臨床樣本的驗證研究，技術方法的標準化和新技術的開發，分析算法的標準化和進一步發展，以及大規模的合作等。