過量攝入游離糖對結腸炎小鼠及腸道菌群的影響

黃慧敏，吳肖肖，王 易，吳 旭

1.西南醫(yī)科大學藥學院藥理系分子藥理（瀘州646000）；2.西南醫(yī)科大學川南醫(yī)學轉化研究院（瀘州 646000）

炎性腸病（inflammatory bowel disease，IBD）在我國發(fā)病率呈逐年增長趨勢，是一種慢性、易復發(fā)性、炎癥性疾病。有研究發(fā)現，IBD 的發(fā)生與飲食因素（特別是高蛋白、高脂飲食）有極大關聯[1-2]。探討飲食因素對IBD 的影響一直是研究的熱點。雖然現有的流行病學研究沒有證據表明高游離糖（free sugar，FS）飲食與IBD的關聯，但是高游離糖一直是IBD病人不被推薦的飲食[3]。游離糖（蔗糖、葡糖糖、果糖）更是被世界衛(wèi)生組織（WHO）強烈推薦限制攝入[4]。然而在日常生活中，我們很容易就會攝入過量的游離糖；游離糖的攝入主要是經過食品或飲料中添加的糖以及天然存在于蜂蜜、糖漿、果汁和濃縮果汁中的糖。有研究表明，高糖飲食與炎癥誘導、菌群失調等密切相關[5-7]；它還是肥胖、非酒精性脂肪肝、糖尿病等慢性非傳染性疾病的危險因子[8-11]。

有研究表明，龍眼鮮果及干品龍眼肉均含有大量游離糖，主要類型為單糖（葡萄糖和果糖）及雙糖（蔗糖）；在干品中，這三種糖總含量高達68.8 ±5.4%，其中蔗糖含量最高（39.1 ± 7.3%），果糖次之（17.7±2.7%），葡萄糖最少（12±4.1%）[12]。因此，我們推斷大量食用龍眼肉將導致過量的游離糖攝入。這可能是過食龍眼肉引發(fā)“上火”（一種與全身炎癥有關的中醫(yī)癥狀）的原因之一[13]。本研究中，我們提出大量食用龍眼肉伴隨的過量游離糖攝入可能會促進小鼠結腸炎的發(fā)展，并使其腸道菌群發(fā)生失調。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠，5 w 齡，體重（20 ±2）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學SPF 級動物房。動物的護理和所有實驗程序均已獲得西南醫(yī)科大學動物的使用和倫理委員會批準（批準號：NO.20202-26）。

1.2 實驗器材

1.2.1 材料與試劑 飼料（南通特洛菲飼料科技有限公司，批號：LAD0011）；葡萄糖，果糖，蔗糖（USA，Sigma-Aldrich）；葡聚糖硫酸鈉，分子量為36 000-50 000（美國國際實驗室，批號：612470）；LPS ELISA Kit（CUSABIO，批號：CSB-E13066 m）；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒（碧玉天，批號：C1088）；蛋白酶K（碧云天，批號：ST533）；4%多聚甲醛（Biosharp，批號：BL539A）；乙醚（成都市科隆化學品有限公司，批號：60-29-7）；磷酸鹽緩沖液（北京索萊寶科技有限公司，型號：P1010）。

1.2.2 主要儀器 多功能酶標儀（Molecular Devices Corporation，型號：Spectran Max 190）；倒置熒光顯微鏡（（NIKON，型號：Ts2R+FL）；低溫高速離心機（Eppendorf，型號：5427R）；超微量分析天枰（美國康州HZ 電子有限公司，型號：HZK-FA210S）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海齊欣科學儀器有限公司，型號：DHP-9082）；渦旋混勻器（IKA公司，型號：C-MAG-HS7）等。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模及給藥方法 將30 只C57BL/6J 小鼠隨機分為對照組，DSS 組和DSS+FS 組，每組10只，在SPF級動物房飼養(yǎng)1周適應環(huán)境后造模。參照文獻采用自由飲用3.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）連續(xù)誘導小鼠5 d建立結腸炎模型，建模成功后恢復小鼠自由飲水。如前文所述按照龍眼肉中游離糖的含量設計一個高劑量游離糖組，劑量為11 g/kg（相當于成人日服用龍眼肉80～112 g）。從實驗第1 d開始，每隔1 d 灌胃1 次FS，其余組灌相同體積的蒸餾水。實驗具體分組給藥方案如圖1所示。

圖1 DSS誘導小鼠結腸炎模型構建與游離糖的治療方案

1.3.2 小鼠體重與結腸長度 每2 d對各組小鼠稱重并觀察其便血、腹瀉等癥狀，第12 d收集小鼠糞便后處死小鼠取出小鼠全結腸并記錄結腸長度。

1.3.3 ELISA測定小鼠血清中LPS水平 小鼠用乙醚麻醉后摘眼球取血，血液于4 ℃過夜后4 ℃3 500 rpm/min 離心10 min，取100 μL 上清進行LPS 檢測，實驗步驟嚴格按照制造商方案進行操作，最后用酶標儀在450 nm波長下測量樣本光密度。

1.3.4 H&E染色 小鼠結腸去除腸內容物用磷酸緩沖液（PBS）清洗后同一部位取1 cm 放置于4%多聚甲醛中固定，經脫水、包埋后切片，采用蘇木精-伊紅染色法制片，在顯微鏡下觀察具體病變。從炎性細胞浸潤（0～3分）、隱窩變形（0～3分）、黏膜脫落（0～3分）三方面對小鼠結腸病變情況進行病理評分。

1.3.5 TUNEL 法檢測細胞凋亡 取石蠟切片，二甲苯中脫蠟5 min。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5 min。無水乙醇5 min。90%乙醇2 min。70%乙醇2 min，蒸餾水2 min；滴加20 μg/mL 蛋白酶K，25 ℃作用20 min，PBS 洗3 次；每個樣本滴加30 μL TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育1 h，PBS 洗3 次；抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。

1.3.6 16 S腸道菌群測序 收集小鼠糞便，提取樣品總DNA 后，根據保守區(qū)設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR 擴增并對其產物進行純化、定量和均化后使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫。利用Illumina 公司的Miseq PE 300 平臺進行測序；對序列進行拼接及注釋；然后對樣本數據進行多方面分析。

1.4 統(tǒng)計分析方法

使用GraphPad Prism 7 對實驗數據進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，各組之間的統(tǒng)計學差異采用One-way ANOVA方差分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 過量攝入游離糖對急性腸炎小鼠的作用

2.1.1 對小鼠體重及結腸長度的影響 如圖2A 所示，實驗第4 d，DSS 組和DSS+FS 組小鼠體重開始下降，無便血現象，糞便顏色正常；第6 d，DSS 組和DSS+FS 組小鼠體重開始驟降，幾乎每只小鼠都出現便血現象，腹瀉嚴重；第8 d，DSS組小鼠體重下降了19%，DSS+FS組小鼠體重下降了24%，便血情況加重。與對照組相比，DSS 組小鼠在第6 d 體重明顯下降（P ＜0.01）。與DSS組相比，DSS+FS組小鼠在第8 d 出現了更明顯的體重損失（P ＜0.01）。如圖2B，2C所示，與對照組小鼠相比，DSS處理后顯著縮短結腸長度（P ＜0.01）；與DSS組相比，給予過量游離糖后進一步使小鼠結腸長度縮短（P ＜0.05），使炎癥加重。

圖2 過量攝入游離糖使DSS誘導的結腸炎小鼠體重下降并使結腸縮短

2.1.2 對小鼠結腸病理組織學的影響 小鼠病理切片及評分如圖3A，3B所示，對照組小鼠黏膜結構完整，隱窩（腺體）排列規(guī)則，杯狀細胞內粘液含量正常，無炎性細胞浸潤；與對照組相比，DSS 處理組黏膜大部分脫落，部分隱窩出現上移現象，隱窩基底部變寬，出現少量炎性浸潤，杯狀細胞粘液減少，病理評分明顯高于對照組（P ＜0.05），證明結腸炎模型成功；與DSS組相比，給予過量游離糖后黏膜廣泛缺失，隱窩出現大量萎縮、扭曲與分支等現象，有大量的炎性細胞浸潤，杯狀細胞粘液幾乎全部消失，病理評分明顯高于DSS組（P＜0.001）。

圖3 過量攝入游離糖加重DSS誘導的結腸炎小鼠病理損傷

2.1.3 對小鼠血清中LPS 含量的影響 與對照組相比，DSS處理后小鼠血清中LPS含量顯著升高（P＜0.001），給予過量游離糖后小鼠血清中LPS 含量比DSS 組進一步顯著升高（P＜0.05）；見圖4。結果提示，攝入游離糖會使小鼠腸黏膜損傷更嚴重，腸通透性增加。

圖4 過量攝入游離糖使DSS誘導的結腸炎小鼠LPS含量升高

2.1.4 對小鼠細胞凋亡的影響 細胞在發(fā)生凋亡時會使基因組DNA 發(fā)生斷裂，斷裂時暴露的3'-OH 可以在末端脫氧核苷酸轉移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）的催化下加上綠色熒光探針熒光素（FITC）標記的dUTP（fluorescein-dUTP），從而可以通過熒光顯微鏡檢測到呈現綠色熒光的凋亡細胞。如圖5A，5B所示與對照組小鼠相比，DSS處理后細胞凋亡率顯著增加（P ＜0.01）;而與DSS 組相比，給予過量游離糖后細胞凋亡率進一步升高（P ＜0.05）。

圖5 過量攝入游離糖加重DSS誘導的結腸炎小鼠細胞凋亡

2.2 過量攝入游離糖對小鼠腸道菌群的影響

2.2.1 Alpha 多樣性分析Alpha 多樣性反映的是單個樣品物種豐富度及物種多樣性，有多種衡量指標，本研究主要分析Sobs 和Shannon 這兩個指數。Sobs 指數衡量物種豐度即物種數量的多少；Shan?non 指數用于衡量物種多樣性，Shannon 值越大，菌群多樣性越高。從圖6A，6B中可以看出，給予3.5%DSS處理后的兩組菌群豐富度顯著減少（P ＜0.01）；給予3.5% DSS 處理后的兩組菌群的多樣性也有所下降，但無顯著性差異。

圖6 Alpha文中表示無顯著性差異多樣性分析

2.2.2 Beta多樣性分析 Beta多樣性（beta diversity）分析主要是比較不同樣品在物種結構方面存在的相似程度。本研究主要采用主坐標分析法（principal co-ordinates analysis）進行比較，其通過一系列的特征值和特征向量進行排序，選擇主要的前幾位特征值，采取降維的思想，找到距離矩陣中最主要的坐標，從而觀察個體或群體間的差異。通過主坐標分析可以實現多個樣品的分類，進一步展示樣品間物種多樣性差異。通過圖7可以看出，與對照組相比，DSS組和DSS+FS 組兩組菌群結構發(fā)生顯著變化（P=0.001），各組間區(qū)分明顯；相較于DSS 組，DSS+FS組對腸道菌群結構的影響差異增大。

圖7 基于OTU水平的PCoA分析

2.2.3 物種分類學分析 基于物種注釋結果，統(tǒng)計分析每個樣本中門和屬水平的菌群變化，以評估每個組在門和屬水平的物種組成差異。從圖8A 和8B可以看出，基于門分類水平主要檢測出8種菌門，其中占比最多的主要是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和疣微菌門（Verrucomicrobia），其余菌群占比較少。與對照組相比，經DSS處理后的兩組擬桿菌門豐度明顯減少（P<0.05）；厚壁菌門豐度顯著增多（P<0.05）；疣微菌門豐度顯著增多（P<0.05）。從圖8C可以看出，屬分類水平物種分析結果表明與對照組相比，DSS 組中norank_f_Muribaculaceae、Faecalibaculum、分節(jié)絲狀菌（Gandidatatus_Arthromitus）、戈登氏桿菌屬（Gordonibacter）豐度顯著減少（P＜0.05），阿克曼氏菌屬（Akkermansia）、消化球菌屬（norank_f_Peptococcaceae）、Romboutsia豐度顯著增加（P＜0.05）；與對照組相比，高劑量游離糖組中norank_f_Muribaculaceae、Faecalibaculum、分節(jié)絲狀菌屬、戈登氏桿菌屬豐度顯著減少（P＜0.05），擬桿菌屬（Bacteroides）、阿克曼氏菌屬、norank_f_Clostridiates_vadinBB60_group、瘤胃球菌屬（Ruminococcus_1）、毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae_UCG_006）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherich-ia_Shigella）豐度顯著增加（P＜0.05）；與模型組相比，高劑量游離糖組中norank_f_Muribaculaceae、Romboutsia豐度顯著減少（P＜0.05），擬桿菌屬、norank_f_Clostridiates_vadinBB60_group、瘤胃球菌屬豐度顯著增加（P ＜0.05）。

圖8 物種分類學分析結果

2.2.4 菌群間顯著差異分析 組間差異顯著性分析主要用于發(fā)現不同組間具有統(tǒng)計學差異的Biomarker，即組間特異性菌群。根據設定的Biomarker 篩選標準（LDA score>3.5）找出符合條件的Biomarker，本研究主要使用LEfSe〔Line Discriminant Analysis（LDA）Effect Size〕分析。從圖9中可以看出，對照組中Muribaculaceae（從科到屬）、擬桿菌目（從門到目）豐度較高；DSS 組中梭菌目（Clostridiales，從綱到目）、放線菌目（Actinobacteria，從綱到目）、蘇黎世桿菌屬（Turicibacter）、變形菌門（Proteobacteria）、變形菌綱（Gammaproteobacteria）等為優(yōu)勢菌群；在DSS+FS 組中擬桿菌科（從屬到科）、厚壁菌門、阿克曼氏菌科（從屬到科）、疣微菌綱（從門到綱）、瘤胃球菌屬、Erysipelatoclostridium等菌群占優(yōu)勢。

圖9 三組差異菌群的LDA評分

3 討論

自由飲用DSS誘導實驗性結腸炎是研究炎性腸病的常用模型，其對腸道上皮細胞有直接的毒性，破壞腸道黏膜屏障完整性并激發(fā)炎癥，臨床上的表現為體重減輕、便血、腹瀉、精神不佳；組織學分析表現為結腸黏膜脫落、隱窩變形、杯狀細胞減少、炎性浸潤以及細胞凋亡。DSS 誘導的結腸炎發(fā)生和發(fā)展都與腸道菌群的失衡有關[14-15]，DSS處理后會使腸道菌群豐富度和多樣性減少，使菌群的結構發(fā)生顯著的改變，腸道內的穩(wěn)態(tài)被破壞可使腸道黏膜屏障完整性降低，會使細菌及LPS 等有害物質透過腸粘膜進入血液[16]。有報告強調，膳食游離糖破壞了小鼠腸道微生物群，促進了結腸炎[17-18]。亦有研究證實，游離糖中尤其是果糖可能會誘導腸道菌過度生長、改變腸道通透性，使致炎因子LPS的吸收增多[19]。雖然很多的研究已表明高脂肪飲食會引發(fā)IBD[20-22]，但是糖的作用尚不明確。最新的一項研究表明，在分別單獨給予葡萄糖、果糖和蔗糖后小鼠更容易患結腸炎或者會使DSS 誘導的結腸炎加重，利用基因測序技術對小鼠腸道菌群進行分析后發(fā)現，大部分的有益細菌豐度減少，三種糖處理后的組小鼠腸道黏液層變薄，使小鼠腸道菌群的組成發(fā)生改變。研究證實，攝入這些高糖后會使腸道菌群發(fā)生明顯的紊亂和改變，從而使腸道黏液屏障受損，使小鼠患結腸炎的易感性增強或者會加重小鼠的結腸炎[23]。

本研究基于龍眼肉中含有大量的游離糖，推斷過食龍眼肉導致游離糖過量攝入，可能促進腸炎。本實驗中，游離糖的劑量根據龍眼肉（過量食用情況下）中的含量計算而得。結果發(fā)現，DSS 誘導的結腸炎小鼠給予FS后，與DSS組相比，體重下降的更多，結腸也縮短的更明顯，組織學顯示結腸細胞凋亡明顯增多，黏膜部分脫落，出現大量的炎性細胞浸潤，隱窩結構出現異常（隱窩扭曲、分支和萎縮）等情況，杯狀細胞丟失嚴重，血清中LPS水平升高顯著，從以上結果得出攝入過量的游離糖促進了DSS誘導的小鼠結腸炎的發(fā)展。此外，在此基礎上對小鼠糞便進行16S rRNA 高通量測序分析菌群的多樣性及差異發(fā)現：給予DSS 處理后兩組菌群豐度及多樣性明顯減少，菌群結構發(fā)生顯著變化，灌胃過量的FS 后對腸道菌群的結構影響最大。與對照組相比，在門水平上，DSS 處理后的兩組擬桿菌門豐度明顯減少而厚壁菌門、疣微菌門以及變形菌門豐度增多；在屬水平上DSS 處理后的兩組norank_f_Muribaculaceae、Faecalibaculum、分節(jié)絲狀菌屬、戈登氏桿菌屬豐度減少，擬桿菌屬、阿克曼氏菌屬、毛螺旋菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬豐度增多。擬桿菌門、norank_f_Muribaculaceae、分節(jié)絲狀菌屬、戈登氏桿菌屬這些腸道菌可能有助于緩解炎癥、抑制有害菌并具有免疫調節(jié)功能[24-25]；厚壁菌門、變形菌門、埃希氏菌-志賀氏菌屬這些腸道菌大部分都為有害細菌的代表，其中變形菌含有病原體，如幽門螺桿菌、霍亂弧菌、志賀氏菌，其增加被認為是生態(tài)失調和炎癥性腸病等疾病風險的診斷標志物[26]。從這些主要的菌群變化中可以看出經過DSS處理會使小鼠腸道致病菌豐度增多而有益菌減少。過量攝入游離糖的小鼠腸道菌群中發(fā)現厚壁菌門、Erysipelatoclostridium為優(yōu)勢菌群，埃希氏菌-志賀氏菌屬明顯比DSS 組豐度增多，提示促進菌群失調。

世界衛(wèi)生組織推薦控制的是“游離糖”[4]，它對健康是不利的[27]，本研究也證實過量的游離糖會促進腸道菌群紊亂，加重DSS 誘導的小鼠結腸炎損傷。糖，尤其是多糖，廣泛存在于中草藥中，如黨參[28]、枸杞[29]、黃芪[30]、龍眼[31]。其抗病毒、免疫調節(jié)、保肝、抗腫瘤、抗氧化、降血糖、降血脂、抗炎癥等藥效已經得到驗證[32-35]。經研究證實多糖會促進有益菌的生長[36-37]，其機制可能是增加游離短鏈脂肪酸（free short chain fatty acids，SCFA）細菌的產生，促進SCFA的生成來發(fā)揮作用[38-39]，改善腸道功能，調節(jié)糖代謝紊亂，從而起到一個保護的作用。本文只是按比例給予了龍眼肉中游離糖的含量，并沒有做龍眼多糖對DSS誘導的小鼠結腸炎的影響實驗，我們猜想龍眼多糖可能會通過調節(jié)腸道菌群，促進有益菌生長，從而對DSS誘導的結腸炎小鼠起到一定的保護作用。

4 結論

過量攝入游離糖會加重小鼠結腸炎進展，使小鼠腸道菌群發(fā)生紊亂，而直接服用龍眼肉是否會引發(fā)腸炎進展還有待進一步研究。