肝癌相關鋅指蛋白/轉錄因子異常機制及其臨床價值

賽文莉，姚 敏，姚登福

1.南通大學附屬醫院臨床醫學研究中心（南通226001）；2.南通大學醫學院免疫學系（南通 226001）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一。HCC 發生的主要病原學因素與慢性持續性乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）感染，非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）及毒物攝入等密切相關[1-3]，為多基因參與、多階段進展的肝細胞惡性轉化。其機制復雜，早期診斷難，治療效果不理想，預后差[4-5]。臨床與基礎的最新研究顯示，鋅指蛋白家族（zinc finger proteins，ZNFs）是人類基因組中最大的轉錄因子家族，是參與調控細胞分化、胚胎發育和多種疾病相關的功能性蛋白質[6]。復雜的ZNFs及其多達18種的Krüppel-like轉錄因子（KLFs）異常與多種腫瘤進展[7]。作為轉錄激活因子調控細胞周期和增殖分化，在肝細胞惡性轉化或HCC 進展中，已發現有多種ZNFs 和至少7 種KLFs參與HCC 細胞增殖、分化、侵襲和轉移過程[8]。本文綜評了HCC 進展密切相關ZNFs 和KLFs 研究的新進展。

1 ZNFs/KLFs結構與功能

由2%人類基因編碼ZNFs具豐富生物多樣性功能，參與調控細胞分化、胚胎發育，參與多種腫瘤進展[8]。除與DNA 結合外，也與RNA、蛋白質和脂質相互作用的能力[9]。依據鋅指半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基所圍繞Zn2＋空間構型，可將ZNFs 分為C2H2樣（C2H2like）、塞結狀（Gag knuckle）、高音譜號（treble clef）、帶 狀（Zinc ribbon）、Zn2/Cys6型（Zn2/Cys6）、TAZ2樣（TAZ2domain like）、短Zn2＋結合環（short Zinc binding loops）和金屬硫蛋白（metallothio?nein）等8 種[6]。廣泛研究的是C2H2型，其蛋白羧基端以線性重復排列，除串聯鋅指結構外含Krüppel相關保守盒（Krüppel-associated box）、痘病毒鋅指（poxvi?rus zinc finger）等功能域[7]。KLFs含17個成員（KLF1～17）由73個氨基酸組成，羧基端含3個保守C2H2結構域，鋅指含23～25個氨基酸，不同成員間高度保守，可激活/抑制靶基因轉錄，優先與“GC box”或“CACCC”位點結合，含與靶DNA結合鋅指結構域[10-11]。

ZNFs含通過結合Zn2+穩定的短的可自我折疊形成“手指”結構的蛋白質，具有重復結構的氨基酸模板，相隔特定距離的胱氨酸結合鋅指，因其自身結構特點可選擇性結合特異的靶結構[12-13]，與靶分子DNA、RNA、DNA-RNA 序列特異性結合，在轉錄和翻譯水平上調控靶向基因表達，在基因表達調控、細胞分化、胚胎發育等過程中發揮重要作用[14-15]。KLFs通過多種調控機制對靶基因進行激活或抑制，控制靶基因表達，功能異同，可分為：①與羧基末端結合蛋白（Ctbp）相互作用的轉錄抑制因子KLF3、KLF8和KLF12；②結合去乙酰酶的轉錄激活因子KLF1～2、KLF4～7；③與共同轉錄輔助抑制因子sin3A 相互作用而產生抑制因子KLF9～11、KLF13～14和KLF16[6，16-17]。KLFs 可調節生長、發育、分化、增殖和胚胎發育等，通過多種調控機制激活或抑制靶基因表達，具有相對組織特異性，誘導多能干細胞，參與機體免疫調節和新血管生成，或與不同啟動子結合后異常轉錄，從而影響腫瘤的生物行為[18-19]。

2 腫瘤相關ZNFs/KLFs表達與調控機制

ZNFs/KLFs分布于人體多種組織，在前列腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌、腸癌、膀胱癌、乳腺癌和宮頸癌等多種腫瘤中異常表達，發揮促癌或抑癌作用[20-25]。睪丸組織表達的ZNF165 為組織特異性抗原（CT-Ag），但三陰性乳腺癌（TNBC）中見CT-Ag表達，與SMAD3結合調控轉化生長因子-β依賴基因轉錄，促進TNBC 細胞增殖和腫瘤生長[26]。原發性結腸癌中ZNF281表達在腫瘤進展過程中增加，并與復發相關，ZNF281 是EMT 調控網絡的一個組成部分，它有助于結直腸癌的轉移形成[27]。膀胱癌中ZNF165 mRNA和蛋白均過表達，可作為一種新的診斷生物標志物或用于發展膀胱腫瘤特異性免疫治療的靶點。KLF6在前列腺癌、神經膠質細胞瘤、結直腸癌、肝癌等中是一種腫瘤抑制因子，不同剪接變異體可在不同腫瘤起源、發展過程中發揮作用[28-29]。

ZNFs 結構復雜，功能巨大，調控機制形式多樣[12，30]，如C2H2型ZNF 在HCC 進展中調控可歸類①轉錄水平調控：ZNFs 基因啟動子CpG 島區域被甲基化，從而抑制ZNFs 基因轉錄；②轉錄后水平調控：ZNFs 蛋白在腫瘤組織中的表達差異由癌癥相關的miRNA 調控；③翻譯后水平調控：不同的環境刺激會激活信號轉導級聯反應，使ZNFs 發生翻譯后修飾，如乙酰化、磷酸化等，PTMs 調控影響ZNFs蛋白與其他蛋白和靶基因DNA結合的能力；④與序列特異性DNA結合水平調控：ZNFs以不同結構域或蛋白翻譯后修飾（protein post-translational modifica?tions，PTMs）結合方式招募相互作用蛋白[31]，包括轉錄輔助激活因子/輔助抑制因子、染色質修飾因子和其他轉錄因子，最終與序列特異性DNA結合激活或抑制下游基因調控細胞的增殖、凋亡、侵襲與轉移，且不同調控層次致ZNFs 在腫瘤發生中的作用機制異同[32]。

3 ZNFs/KLFs對HCC的促進作用

ZNFs/KLFs 表達在HCC 進展過程中發揮調控作用，包括轉錄輔助激活因子/輔助抑制因子、染色質修飾因子和其他轉錄因子，最終與序列特異性DNA 結合激活下游基因調控癌細胞增殖、抑制凋亡、促進侵襲或轉移等，肝癌相關ZNFs/KLFs的促進作用歸納詳見表1。

表1 幾種肝癌相關ZNFs/KLFs的促癌作用[33-48]

3.1 促進肝癌細胞增殖

由12個鋅指結構域組成的ZNF233在HCC組織中顯著過表達，與患者的腫瘤分期及預后相關，細胞研究證實敲除ZNF233基因可抑制癌細胞增殖[30]；定位于1號染色體的ZNF281（ZBP99）由Snail 和miR-34a/b/c共同調控，參與胚胎干細胞分化與組織發育，其表達促HCC 增殖與轉移有關；沉默ZNF281顯著下調炎癥介質（IL-8，IL-1 β，IL-17，IL-23）和上皮間質轉化（EMT）信號、TIMP-1、纖維連接蛋白和α-SMA 表達，EMT 誘導因子Snail 直接誘導ZNF281轉錄，抑制miR-34a/b/c，緩解ZNF281mRNA被miR-34 下調[34]。HCC 組織ZNF384 表達，上調Cy?clin D1促HCC細胞增殖，且與腫瘤復發和總體生存率差明顯相關[35]。ZNF191 與Wnt8B 啟動子nt1491（ATTAATT）和nt1178（ATTC ATT）結合，經Wnt 通路促進HCC增殖；HCC組織中ZNF143過表達，通過與序列特異性DNA結合，具轉錄因子活性在體內外促進癌細胞增殖、集落形成和腫瘤生長[36-37]。肝癌ZNF267、ZNF217 和ZNF667 過表達，通過調節Bcl-2和Bax表達促進細胞增殖、侵襲和遷移[38-40]；KLF5過表達上調CD44 使HCC 細胞耐藥，小干擾RNA 敲除KLF5，影響HCC細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學行為[41]。

3.2 阻斷促凋亡信號

ZNF32 定位于10q23-q24 染色體區域，在HCC顯著上調，在活性氧（ROS）下SP1 靶向激活ZNF32轉錄、靶基因補體1q結合蛋白（C1QBP）活化逃避氧化應激誘導的凋亡；ZNF689 具有致瘤性，與轉錄輔助阻遏物TIF1β相互作用，通過抑制Bak/Bax/Bid 通路阻斷促凋亡信號，其表達與瘤體大小、包膜浸潤及微血管浸潤顯著相關；ZNF689過表達者總生存時間短、預后差[42-43]。

3.3 促新血管生成與復發

HCC 組 織ZNF687 為C2H2型，其上調活化NF-kB 靶基因參與調節新血管生成[44]。KLF8 為促癌基因，肝癌KLF8 表達與MMP-9 正相關，MMP-9 是KLF8 下游靶基因，KLF8 表達致MMP-9 增加，促進癌細胞的浸潤及轉移，KLF8 通過PI3K/AKT 通路誘導VEGF 表達，可活化Wnt/β-catenin 通路參與肝癌浸潤和轉移，Wnt3a可刺激KLF8表達；另KLF8表達提高β-catenin 對T-cell factor 4 的招募能力，誘導下游靶基因c-Myc、cyclin D1 及Axin1 活化，促進HCC轉移與復發[45-46]。

3.4 其它作用

胚胎干細胞（ESC）和造血干細胞中ZFX 高表達，在51.8%肝癌過表達，體外細胞水平上，沉默ZFX 基因轉錄使癌細胞發生G0/G1 期阻滯，而抑制HCC細胞的自我更新、集落形成和細胞增殖能力，使HCC對順鉑藥物敏感性增加；ZFX與Nanog和Sox-2啟動子結合后在HCC細胞中過表達，體內移植模型顯示ZFX過表達促進HCC生長，顯示肝癌細胞具有干性和多功能性[47]。HCC中表達的ZNF165核苷酸序列與睪丸中ZNF165相同，以重組ZNF165，測定HCC患者ZNF165，僅5%患者血清檢到ZNF165 抗體，表明ZNF165 為新的CT 抗原，引起體液免疫反應參與腫瘤生物學[48]。

4 ZNFs/KLFs對HCC的抑制作用

同樣，龐大的ZNFs/KLFs 表達在HCC 進展過程中，發揮轉錄抑制、激活下游抑癌基因、誘導細胞凋亡、激活P53、抑制相關通路關鍵信號分子阻止癌細胞EMT 轉化，對HCC 侵襲或轉移等具有抑制作用，臨床及基礎研究發現的主要相關ZNFs/KLFs，見表2。

表2 幾種肝癌相關ZNFs/KLFs的抑癌作用[49-60]

4.1 誘導肝癌細胞凋亡

ZNF307（ZKSCAN4、ZSCAN36 和ZNF427）顯著下調，作為一種腫瘤抑制劑通過誘導細胞凋亡抑制癌細胞增殖。HCC 組織和細胞中ZNF307 過表達，調控凋亡關鍵因子如caspase-3、BAX 和BCL-2，促進細胞凋亡[49]。ZBP89（ZNF148、BFCOL1和BERF-1）與Bak 啟動子靶向結合促進其轉錄，抑制干性細胞更新，誘導癌細胞凋亡[50]。KLF9為抑癌基因，在肝癌組織表達下調。KLF9直接結合p53啟動子近端區域內GC盒穩定p53，其藥理學或遺傳活化對HCC可能具有治療作用，對SK-Hep1和HepG2細胞生長有明顯抑制作用，并致細胞凋亡[51]。位于19q13.13號染色體上ZNF545過表達，可抑制肝癌Snur449和Huh7細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞G1/S期阻滯和凋亡，體內、外研究證實其機制為抑制NF-KB 活化、細胞增殖和移植瘤生長[52]。

4.2 抑制相關通路信號分子

ZNF774是一個轉錄抑制因子，親和純化偶聯質譜法顯示ZNF774與胞中Mi-2/核小體重構和去乙酰化酶復合物（NuRD）有關聯，全基因組鑒定ZNF774/NuRD 復合體表明，ZNF774 抑制含notch2 肝癌生長和遷移密切相關基因，體外抑制癌細胞增殖和侵襲，體內抑制癌細胞生長和轉移。ZNF774明顯下調與高notch2 表達、晚期病理分期及患者總體生存率低密切相關，提示ZNF774/NuRD-notch 2 軸在肝癌發生中的關鍵作用[53]。KLF10 或稱轉化生長因子-β誘導早期基因1（TIEG1），為含三C2H2 鋅指結構域的DNA 結合轉錄調節因子，與DNA 上特異性蛋白1（SP1）位點結合并與其他調控轉錄因子相互作用促進/抑制基因表達，具有抗增殖作用，誘導多種癌細胞凋亡[54]。

4.3 抑制HCC侵襲轉移

抑制腫瘤轉移和上皮間質轉化（EMT）有關。位于19q13.13 號染色體ZNF382，在HBV 陰性肝組織和HBV 感染肝硬化組織中表達顯著增高，是mir-6867靶標，作為一種潛在癌細胞抑制因子，可激活蛋白1（AP-1）和Wnt/β-catenin 通路活化，激活p53表達，誘導凋亡，抑制原癌基因FOS和JUN等下游靶點發揮作用，抑制裸鼠癌細胞增殖、集落形成、遷移、侵襲和致瘤潛能，抑癌基因ZNF382在HBV相關HCC 中受表觀遺傳機制調節[55]。CD9 和CD81 是KLF4 轉錄靶點，調控KLF4-CD9/CD81-jnk 信號通路，有望抑制HCC發展[56]。轉化生長因子β-1（TGF-β 1）/Smad 信號通路在腫瘤抑制中起重要作用，KLF17調控Smad3依賴途徑增強TGF-β1/smad信號轉導，是抗腫瘤轉移和抑制腫瘤生長關鍵環節。沉默KLF17 可降低Smad 結合元件上Smad3-DNA 形成，影響TGF-β1/Smad靶基因表達，調控該通路經EMT抑制HCC侵襲轉移[57]。

4.4 其它作用

由4 個外顯子構成的KLF6 位于10p15，含有3個剪接變異體（SV1、SV2、SV3）。KLF6為癌胚抗原具有轉錄激活功能，不同剪接變異體在腫瘤中發揮不同作用；肝癌中KLF6 SV1為促癌基因，KLF6 SV2是抑癌因子，分別發揮促癌細胞增殖和抗細胞增殖或凋亡作用[58-59]。脂肪生成被認為是肝癌發生發展關鍵，ZHX2 為新生脂肪形成的重要抑制因子，異位表達顯著抑制HCC 新脂肪生成，降低FASN、ACL、ACC1 和SCD1 轉錄，與脂肪調控因子SREBP1c 呈負相關。沉默或過表達ZHX2，轉錄水平上增加mir-24-3p 作用于SREBP1c 靶點致其降解，提示ZHX2 抑制肝癌進展新機制，可為HCC 治療提供新策略[60]。

5 ZNFs/KLFs分析的臨床價值

肝癌相關ZNFs/KLFs 基因轉錄異常，在肝癌組織或循環血中的表達水平改變，有助于良惡性肝病診斷、HCC預后判別或分子靶向治療。

5.1 良、惡性肝病鑒別

肝癌ZNF191 過表達直接轉錄調控，在HCC 增殖中發揮關鍵作用[36]；KLF4 為誘導HCC分化介質，可提高HCC 預測準確性[61]；KLF5 轉錄因子在良、惡肝病中的表達存在顯著差異，有助于良、惡性肝病的診斷與鑒別診斷，初步臨床應用（待發表資料），顯示可特異診斷HCC，優于常規AFP分析。

5.2 預后標志物

肝癌患者組織或血ZNF281、ZNF384、KLF5 等表達升高，與瘤體大小、腫瘤分期、腫瘤復發及血管侵襲性等呈正相關，與患者的總體生存率差相關；HCC 組織KLF4 和Sp1 表達與腫瘤分化顯著相關；KLF6 與HCC 患者淋巴血管空間侵襲呈負相關，KLF6 陰性患者生存時間短。KLF17 是抑癌基因，能與突變型p53 形成復合物抑制HCC 患者的EMT 形成。HCC 中ZFHX3 上調，是HIF-1a/VEGFA 的血管生成因子所必需，可見ZNF281、ZNF384、KLF5 等表達升高，與瘤體大小、腫瘤分期、腫瘤復發及血管侵襲性等相關，與患者總體生存率相關，可作為HCC預后標志物[34-35，41，58]。

5.3 分子靶標

ZNF267參與調控發育、增殖和分化等生物學過程，在肝硬化及癌組織均升高，靶向ZNF267 可抑制HCC 增殖和遷移[38]。ZNF191 與Wnt8b mRNA 啟動子ATTAATT（nt-1491）和ATTCATT（nt-1178）結合，直接調控轉錄，在HCC 進展中發揮關鍵作用[36]。KLF6過表達抑制了異種移植腫瘤的生長，在體外和體內抑制HCC生長和侵襲，具抑癌功能可能用于預防和治療[58]。KLF5激活PI3K/AKT/Snail通路誘導EMT發生，是調控HCC中CSCs關鍵轉錄因子[41]。KLF8激活wnt/β-連環蛋白促干細胞樣，靶向KLF8可抑制HCC[45]。另ZHX2 表達增加miR-24-3p，可靶向SREBP1c 抑制HCC進展[60]。位于20q13的ZNF217基因與miR101結合，可促進癌細胞增殖與侵襲，以及ZNF23等調控HCC增殖和分化，均可望成為HCC治療靶點[30，39，62]。

6 展望

ZNFs/KLFs作為人類基因組中最大的轉錄因子家族，廣泛參與了人體多種生物學過程，在肝細胞惡性轉化中調節下游基因轉錄，參與細胞增殖、凋亡、侵襲與轉移，發揮促癌/抑癌作用。現有資料顯示ZNFs/KLFs的轉錄表達，與HCC關系密切，已引起醫學界的高度重視，但因該家族相關分子種類繁多、結構復雜，隨著對該家族相關因子研究的深入，解析HCC 發病機制和論證有價值的關鍵ZNFs/KLFs 分子，將有助于HCC 早期診斷和預后判斷，以及特異分子靶向干預技術開發與臨床應用。