反義寡核苷酸技術(shù)在植物中的應(yīng)用現(xiàn)狀

王 瀟

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036）

asODN技術(shù)是一類經(jīng)人工合成或構(gòu)建的反義表達載體，用于表達的寡核苷酸片段，通過堿基互補原理，干擾基因的解旋、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、mRNA的剪接加工、輸出和翻譯等各個環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、分化等。asODN技術(shù)首次在抑制肉瘤病毒復(fù)制和細胞轉(zhuǎn)化時被提出，之后便逐漸被應(yīng)用于腫瘤細胞的表達抑制。鑒于植物細胞對asODN片段吸收的限制性，asODN技術(shù)在植物上的應(yīng)用在“糖溶液途徑”被證實后在植物基因上的研究才逐步開始，但仍需要對其進行進一步的優(yōu)化設(shè)計，以更好發(fā)揮asODN技術(shù)的優(yōu)勢。

asODN技術(shù)有著獨特的優(yōu)勢，主要是對基因進行瞬時沉默抑制，從而研究基因在植物中的功能。此技術(shù)一定程度上可彌補其他技術(shù)的缺陷，與標記基因相比在對轉(zhuǎn)基因植物進行選擇時不改變植物性狀或應(yīng)用于像茶樹這類存在轉(zhuǎn)基因難題的植物以沉默基因。因此，asODN技術(shù)在研究植物基因方面有很大的應(yīng)用價值。

1 反義寡核苷酸技術(shù)在植物中的研究進展

1.1 糖溶液中植物對asODN的吸收

1978年，Zamecnik等首次提出將asODN技術(shù)應(yīng)用于動物研究，通過特定的寡氧核苷酸片段抑制肉瘤病毒復(fù)制和細胞轉(zhuǎn)化。Tridecamer d是一段與13個核苷酸的肉瘤病毒互補的序列，這段序列被添加到小雞胚胎的纖維細胞組織中培養(yǎng)感染肉瘤病毒，從而抑制了病毒生產(chǎn)。此后，asODN技術(shù)開始逐漸應(yīng)用于動物基因研究[1]。

現(xiàn)有研究已證明植物在糖溶液中可以攝取asODN，所以asODN技術(shù)也逐漸應(yīng)用于植物上了。植物中糖信號通路與細菌、酵母、動物相比還了解甚少，Chuanxin Sun等（2005）基于糖誘導(dǎo)的基因，以SUSIBA2作為轉(zhuǎn)錄因子，通過asODN抑制SUSIBA2表達，確定SUSIBA2是植物糖信號傳導(dǎo)中的轉(zhuǎn)錄激活因子。此研究成功在植物生物學(xué)中應(yīng)用了asODN技術(shù)，為驗證植物可在糖溶液中吸收asODN奠定了基礎(chǔ)。Chuanxin Sun等（2007）發(fā)現(xiàn)糖的運輸可以向大麥種子提供ODN，并且這種策略可用于通過asODN抑制來抑制胚乳細胞中的基因活性，因此，asODN的糖溶液吸收途徑被稱作植物細胞中反義寡氧核苷酸的“入境口岸”。Roxanne Y.Walder和Joseph A.Walder（1988）采用設(shè)計的寡核苷酸針對小鼠α-或β-珠蛋白mRNA的不同區(qū)域進行試驗，發(fā)現(xiàn)新鮮制備的網(wǎng)狀細胞裂解物在有核細胞中含有1%~2%的RNaseH，在活性翻譯的條件下，這種活性水平足以在1 h內(nèi)與互補的寡脫氧核苷酸雜交的位點上裂解幾乎100%的目標mRNA，使用poly（rA）·oligo（dT）作為酶的競爭性抑制劑，發(fā)現(xiàn)寡脫氧核苷酸與跨越起始密碼子的序列或編碼區(qū)中的序列互補的雜交阻滯完全歸因于RNase對mRNA的切割，提出RNaseH對mRNA的切割裂解是主要的抑制途徑[2]。

為更好地促進asODN技術(shù)在植物上的應(yīng)用，Chuanxin Sun等（2008）基于已有的研究成果，評論了植物中asODN吸收的特異性機制，即asODN與靶mRNA結(jié)合形成的雙鏈雜交體能夠激活核糖核酸酶（RNaseH）裂解靶mRNA，進而抑制了蛋白質(zhì)的翻譯與基因的表達。同年，Chuanxin Sun等（2008）總結(jié)性地提出ODN抑制是植物細胞中檢測基因功能的有效手段，并且采用asODN抑制基因表達的方法，確定了SUSIBA2轉(zhuǎn)錄因子在大麥胚乳中調(diào)控淀粉合成的重要性，也證明了asODN技術(shù)在大麥葉淀粉分支酶活性研究中的適用性。

1.2 asODN技術(shù)在植物上的應(yīng)用

自從植物在糖溶液中能夠更好吸收asODN的觀點被證實后，asODN能夠?qū)虮磉_進行選擇性抑制的優(yōu)勢被更多地應(yīng)用于植物基因的研究。

目前，asODN技術(shù)在植物上的應(yīng)用主要分為2個方面，一方面是基于反義寡聚脫氧核苷酸抑制的植物轉(zhuǎn)化選擇策略，例如Zhoupeng Xie等（2014）將asODN技術(shù)應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因研究上所做的實驗，取得突破性研究成果。通常轉(zhuǎn)基因植物的篩選是把目的基因和標記基因一起引入細胞，實驗中發(fā)現(xiàn)引入標記基因可能會帶給轉(zhuǎn)基因植物新的性狀，如對抗生素、除草劑的抗性，從而引起環(huán)境污染、植物性狀改變等不利影響，通過asODN的抑制作用選擇轉(zhuǎn)化植物細胞則能夠很好地解決這個問題[3]。另一方面，asODN技術(shù)更多地被應(yīng)用于對基因進行瞬時抑制，從而驗證基因的功能，且大多關(guān)于驗證有關(guān)植物有性繁殖的機理。植物的有性繁殖是雄配子的花粉管伸長并穿透雌蕊實現(xiàn)受精，但這個分子受精的機制還不清楚。Yoko Mizuta和Tetsuya Higashiyama（2014）用無細胞轉(zhuǎn)染素的硫代磷酸脂反義寡脫氧核苷酸在擬南芥花粉管中對基因的功能進行瞬時抑制，用AS-ODN抑制ANX1和ANX2表達的擬南芥花粉管表現(xiàn)出短、打結(jié)和斷裂的形態(tài)特征，而在正義對照中則顯示正常的花粉管形態(tài)生長[4]。抗熒光蛋白（sGFP）的AS-ODN導(dǎo)致sGFP表達降低，表明AS-ODN抑制了蛋白表達。該方法將能夠鑒定擬南芥PT中與生殖相關(guān)的重要基因，從而進一步研究分子受精的機制。

自交不親和（SI）是開花植物出現(xiàn)生殖隔離現(xiàn)象的機制之一，最近的研究提供的相關(guān)證據(jù)表明S-RNase是非選擇性轉(zhuǎn)運到花粉管中的，但未說明這種轉(zhuǎn)運是如何完成的。Dong Meng等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，蘋果（Malus domestica）MdABCF蛋白有助于將S-RNase轉(zhuǎn)運到花粉管中，當(dāng)MdABCF被反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染沉默時，S-RNase無法進入花粉管，認為MdABCF有助于將自身或非自身的S-RNase轉(zhuǎn)運到花粉管中，SRNase轉(zhuǎn)運的阻滯破壞了該系統(tǒng)中的自我不相容性，從而在一定程度上有助于解除植物自交不親和。基于以上研究，Dong Meng等（2018）利用反義寡核苷酸手段抑制花粉中的MdMYB39L表達，使山梨糖醇合成減少從而使雄蕊發(fā)育異常、花粉管生長減少,結(jié)果表明山梨糖醇通過蘋果中的Md-MYB39L在雄蕊發(fā)育和花粉管生長中起著重要作用。HuiJun Jiao等（2019）應(yīng)用相似的方法，提出PbrPCCP1介導(dǎo)PbrTTS1信號傳導(dǎo)從而控制梨中花粉管的生長的觀點，發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過asODN敲低PbrPCCP1表達水平時，花粉管的生長受到抑制，PbrTTS1的促進作用減弱,PbrPCCP1和PbrTTS1可以共同調(diào)節(jié)花粉管的生長。

2 結(jié)論和展望

asODN技術(shù)被首次提出并逐漸成熟應(yīng)用于動物基因研究上，近年來隨著此技術(shù)在植物上的應(yīng)用障礙被逐步突破，asODN技術(shù)在植物基因方面研究中的重要意義也凸顯出來，在選擇轉(zhuǎn)基因植物與驗證植物某個基因的功能方面作出了貢獻，但在實際實驗應(yīng)用中仍發(fā)現(xiàn)一些問題和不足之處亟待解決和優(yōu)化，如需要對asODN優(yōu)化設(shè)計使其定點作用于特定部位，使靶組織最大效率吸收asODN并盡量降低毒副作用；需要對asODN片段進行化學(xué)修飾以提高其穩(wěn)定性、延長其半衰期、增加其作用時間等；需要逐漸建立起一套穩(wěn)定的、以asODN技術(shù)為基礎(chǔ)的基因瞬時沉默體系，以使此技術(shù)發(fā)揮出更大的優(yōu)勢。