廣東小耳花豬冷凍精液制備效果影響因素分析

鐘觀新

（廣東省遂溪縣動物衛生監督所 524300）

精液冷凍是精液經過特殊處理后，在極低溫度下（-196℃）保存，抑制精子代謝活動，使精子生命在靜止狀態下保存下來，升溫又能復蘇而不失去授精能力的一種長期保存精液的方法。在種質資源保護、減少公豬飼養量及開展跨地區遺傳交流等方面具有重要意義。但豬精子對溫度變化的敏感性，使其在冷凍解凍過程中易受損傷，導致豬冷凍精液的生產難度大。豬冷凍精液技術的關鍵在于豬精子在冷凍和解凍過程中是否失去活力、保持受精能力等。對于地方豬種而言，精液冷凍保存技術可以對瀕危家畜及珍稀動物的保種提供技術支持。本文對影響廣東小耳花豬細管法精液冷凍保存效果的因素進行分析，為廣東小耳花豬冷凍精液制作提供參考。

1 廣東小耳花豬的個體差異

豬精子射精量大，采精后對外界溫度的突然改變相當敏感。外界因素、精子本身生物學特性、種公豬個體差異和每次采精的質量差異都會影響凍精效果。在常溫保存下，廣東小耳花豬的精液保存時間存在個體差異性，體現出不同個體間或不同時間采集的精液對溫度耐受力不一。筆者在對廣東小耳花豬精液進行冷凍保存的過程中，發現來源不同個體、品質相近、同一批次精液，最終凍精復蘇后的品質不一、存在著某些個體凍精效果差，一般復蘇后活力在0.4 左右、高者可以達到0.6、低者甚至在0.1 以下。

2 稀釋、常溫平衡

豬精子細胞對溫度的變化特別敏感，尤其是降溫，因此，不但要求精子對低溫有耐受能力，而且要能經受從射精時體溫到保存時超低溫的變化。在整個過程中要求精子活力、形態都能夠保持基本不變。因此在對廣東小耳花豬精液做冷凍保存時，使精液安全度過致命溫度。采精后需馬上對精液進行稀釋，研究表明，豬精液按照0.25、0.5、0.75、1 億/ml 稀釋時，17℃保存24h 后活力保持在0.8 以上。廣東小耳花豬精液密度在1.5 億/ml 之間，因此可0.5～1 倍稀釋。在25℃下達到平衡后轉移至17℃冷柜中平衡，平衡2.5～4h；超過5h，在離心時易使精子黏附管壁造成損耗，從而影響復蘇后活力。

3 離心速率與時間

豬精液離心后棄去上清液，用冷凍稀釋液重懸浮，使冷凍保護物質充分接觸，可以提高精液冷凍后的活力。研究表明，豬精液800r/min 的離心效果明顯好于500r/min 和1000r/min[1]。宋先忱等[2]認為，遼寧絨山羊精液以800～1200r/min，可明顯提高細管凍精的冷凍效果。以上研究表明，不同品種精液對離心的條件及轉速要求不同。筆者在廣東小耳花豬的精液冷凍保存過程中發現：精液在17℃中經1500r/min 離心12min 后易分離精清，減少有效精子的浪費，同時減少機械性損傷，冷凍效果較好。

4 冷凍稀釋液種類

在降溫過程中，精子細胞外及冷凍稀釋液中的水分開始形成冰晶，造成溶質濃度增高，導致精子細胞脫水，原生質變干，電解質濃度增高，酸堿度失去平衡，最終精子因受到冰晶化產生的化學性傷害而死亡。甘油及卵黃是精液冷凍稀釋液中必不可缺的抗冷凍物質。另外，黃俻華等[3]對陸川豬精液冷凍稀釋液的研究表明，冷凍稀釋中添加600μg/ml VC和600μg/ml VE，能有效防止冷凍精子發生過氧化反應，提高精子頂體完整率，降低精子畸形率，增加解凍后精子的活力。筆者在對廣東小耳花豬精液冷凍過程中發現，加入新鮮雞蛋卵黃要比陳舊雞蛋卵黃效果要好。

5 低溫平衡時間及溫度

精子細胞有其適宜的冷凍與解凍速率要求，冷凍速率太慢時，保存的細胞易受高濃度溶液的影響而遭到破壞或死亡（溶液效應）。因此，在冷凍時要經過平衡時間是影響冷凍復蘇精子存活率的一個重要因素。對于不同動物來說，甘油透過精子細胞膜的速度不同，對低溫耐受性也不同。目前，應用水浴降溫是一種較穩定的降溫方法，水浴過程溫度差不超過1℃。將降溫速率控制在2～3min/℃可提高豬精液的冷凍成功率，并在5℃平衡2～4h。平衡時間受冷凍載體的容積和精子密度的影響，容積越大或密度越高，精液平衡時間越長，反之平衡時間越短。在整個過程，嚴格控制精液溫度，防止精液回溫。

6 熏蒸時間及高度

冷凍過程是影響精液冷凍效果的關鍵步驟，可用冷凍儀和液氮熏蒸進行精液冷凍，而液氮熏蒸方法設備簡單便宜，易被中小企業采用。對豬精液超低溫冷凍保存的研究指出，5ml 細管在距液氮面3cm 熏蒸20min，冷凍效果明顯優于5cm 及7cm；0.25ml 細管在距液氮面5cm 進行熏蒸，冷凍效果優于3cm 及7cm。劉莉[4]研究指出，距離液氮面2cm、5cm 熏蒸較之9cm 處熏蒸效果顯著提升，并且5cm 處熏蒸精子頂體完整率顯著高于2cm 處。筆者對廣東小耳花豬的精液進行冷凍保存時，0.5ml 細管距離液氮面3cm 熏蒸8min 效果優于2cm 及5cm。

7 復蘇工藝

凍精在復蘇過程中的關鍵點在于使精子細胞安全通過冰晶化危險溫度區，即0～6℃低溫區域。李青旺等[5]用干解法與濕解法對同一批次豬凍精的研究中指出，干解法解凍后精液活力明顯高于濕解法解凍的精液活力。馬紅等[6]在37、42 及47℃對民豬凍精解凍30s 后發現，精子頂體完整率在42 及47℃解凍時明顯高于37℃解凍的精子頂體完整率。筆者在試驗過程中發現，廣東小耳花豬0.5ml 細管在50℃水浴15s 解凍效果最佳。

8 問題與展望

目前，豬精液冷凍過程中的冷凍與復蘇機理尚未研究透徹，對于廣東小耳花豬精液冷凍及復蘇條件仍需摸索，同等條件下杜洛克和廣東小耳花豬精液冷凍復蘇后，前者活力可達帶0.6 以上，后者平均活力只有0.4。廣東小耳花豬作為廣東區域優良的地方豬品種，在應對國外豬種及“非洲豬瘟” 的雙重挑戰下進行精液冷凍保存在保護種質資源、推廣利用方面具有重要作用。因此，需要加強對廣東小耳花豬精液冷凍的研究，探索更適宜的冷凍方法提高精液冷凍成功率。