自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究進展

徐潔，王麗媛，于洋，唐小鐵

(1.武漢科技大學醫(yī)學院，武漢 430080；2.武漢科技大學附屬普仁醫(yī)院腎內(nèi)科，武漢 430080)

臨床上，急性腎損傷具有發(fā)病率高、病死率高的特點，給患者和社會帶來極大的經(jīng)濟負擔，是全球性的嚴重的醫(yī)療保健問題[1]。流行病學研究表明，急性腎損傷是終末期腎臟病的主要危險因素，常發(fā)展為慢性腎臟病[2]。腎臟缺血再灌注損傷是指缺血的腎臟在完全或部分恢復血流灌注后出現(xiàn)損傷加重及腎功能惡化(即腎組織細胞缺血缺氧、腎小管細胞損傷)而引起的腎臟損傷[3]。腎臟缺血再灌注損傷常見于心血管手術(shù)、創(chuàng)傷、休克和腎移植的患者，是臨床上急性腎損傷最常見的病因[4]，其發(fā)生機制非常復雜，是引起腎衰竭和影響預后的重要原因，但目前尚缺乏有效的治療策略[5]。導致腎臟缺血再灌注損傷的機制主要包括能量代謝障礙、鈣超載、線粒體損傷、氧化應激反應、炎癥反應、細胞凋亡及自噬等[6]。自噬廣泛存在于真核生物內(nèi)，在調(diào)節(jié)細胞生命活動中具有重要作用[7]。許多疾病的發(fā)生、發(fā)展均涉及自噬，如感染、腫瘤、代謝性疾病[8]。目前自噬是各領(lǐng)域的研究熱點，其中，腎小管上皮細胞的自噬是目前關(guān)注的焦點。在急性腎損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中，自噬相關(guān)信號通路上的關(guān)鍵部位可能為急性腎損傷的治療提供新的策略[9]，但自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的作用尚存在爭議，現(xiàn)就自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究進展予以綜述。

1 自噬的基本概念和發(fā)生過程

1.1自噬的基本概念 1962年，Ashford和Porter[10]在研究人肝細胞時，在電子顯微鏡下觀察到了自噬；隨后Tsukada和Ohsumi[11]在研究酵母時發(fā)現(xiàn)了自噬相關(guān)的分子機制；1969年在藥物誘導的腎損傷小鼠近曲小管中首次發(fā)現(xiàn)了包含受損細胞器的自噬體[12]。隨著研究的深入，自噬在急性腎損傷中的研究取得重大進展。自噬通過參與受損細胞器以及蛋白質(zhì)的清除和再循環(huán)實現(xiàn)胞質(zhì)成分更新，以保持細胞內(nèi)平衡，并參與細胞生長、生存的調(diào)節(jié)，是機體進化過程中保守的代謝機制，對組織細胞具有保護作用。自噬時溶酶體水解酶降解細胞內(nèi)受損的大分子、蛋白質(zhì)聚集物和功能失調(diào)的細胞器，降解后的成分被回收，用于合成細胞生命活動所需的蛋白質(zhì)、細胞器和能量等[13-14]。在生理條件下，自噬的順利進行有助于維持細胞內(nèi)外穩(wěn)態(tài)，進而維持機體穩(wěn)態(tài)[15]，在人體各項生命活動的順利進行中均發(fā)揮重要作用。膿毒血癥、腎急性缺血以及藥物和重金屬誘導的腎毒性是引起急性腎損傷的常見原因，為了應對這些壓力，自噬途徑被激活[16]。通常情況下發(fā)生的自噬對組織細胞具有保護作用，但過強的刺激導致自噬過度也可能加重組織細胞損傷，甚至引起細胞死亡，稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[17]。

根據(jù)細胞內(nèi)容物運輸至溶酶體的方式，哺乳動物內(nèi)的自噬包括巨自噬、微自噬和伴侶介導的自噬。巨自噬就是通常所說的“自噬”，是主要且廣泛研究的降解或消除受損細胞器和蛋白質(zhì)的自噬途徑，底物蛋白被雙層膜的結(jié)構(gòu)包裹后形成自噬體，并運輸至溶酶體內(nèi)進行消化水解[18]。微自噬及伴侶介導的自噬研究較少。

1.2自噬的發(fā)生過程 自噬的發(fā)生過程非常復雜，主要分為3個階段，即自噬體形成、自噬體與溶酶體融合以及自噬溶酶體降解。自噬體的形成涉及多個自噬相關(guān)蛋白(autophagy related protein，Atg)復合體的協(xié)同作用，主要包括UNC-51樣激酶(uncoordinated 51-like kinase，ULK)1/2復合體、Beclin-1/Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復合體、Atg12-Atg5-Atg16 L1復合體以及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ(microtubule-associated protein 1 light chain 3Ⅱ，LC3Ⅱ)的修飾等。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)及AMP活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)共同參與ULK1/ULK2復合體的調(diào)節(jié)，以激活自噬[19]；隨后，Beclin-1/Ⅲ類磷脂酰肌醇-3激酶復合物啟動細胞膜泡成核，同時結(jié)合Atg21和Atg24到膜上，形成自噬體的前體裝配結(jié)構(gòu)[20]。隔膜的延伸、閉合、形成自噬體涉及2條泛素化途徑：Atg12-Atg10中間體形成后促進Atg12和Atg5轉(zhuǎn)移，形成共價連接的Atg12-Atg5與Atg16L1結(jié)合形成Atg12-Atg5-Atg16L1復合體[21]；隨后，Atg12-Atg5-Atg16L1復合體被招募至吞噬泡膜上，通過與磷脂酰乙醇胺共價結(jié)合生成脂化LC3[22]；LC3被Atg4分解為LC3Ⅰ后被E1樣酶Atg7激活，轉(zhuǎn)運至Atg3，與磷脂酰乙醇結(jié)合成為LC3-磷脂酰乙醇(即LC3Ⅱ)，LC3Ⅱ是自噬體外膜和內(nèi)膜的重要組成部分，而Atg12-Atg5-Atg16L1復合體只存在于自噬體的外膜[23]。

成熟的自噬體和溶酶體結(jié)合形成的自噬溶酶體可將其內(nèi)底物進行降解，自噬生物學功能的順利進行依賴上述過程的順利完成。正常情況下，細胞內(nèi)可觀察到少量自噬體，自噬活性提高，觀察到的自噬體增多；另外，自噬體與溶酶體結(jié)合障礙或者自噬溶酶體降解障礙引起自噬體無法清除，檢測到的自噬水平也可增高[24]。

2 自噬在腎缺血再灌注損傷中的雙重作用

自噬在腎缺血再灌注損傷的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，許多體內(nèi)外實驗中均觀察到在腎缺血再灌注損傷過程中自噬被激活[25-26]，但表達上調(diào)的自噬究竟對腎臟起保護作用還是加劇腎臟損傷目前仍存在爭議。一方面，自噬可降解異常細胞內(nèi)異常的蛋白及細胞器，防止有害物質(zhì)的積累，對細胞的生存起到保護作用；另一方面，過高水平的自噬可損傷細胞器，使其轉(zhuǎn)化為自噬細胞死亡。因此，自噬在腎缺血再灌注損傷中是把雙刃劍。

2.1自噬對腎缺血再灌注損傷的保護作用 目前已有超過40種自噬相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)，為驗證自噬在腎缺血再灌注損傷中的作用，特異性剔除自噬相關(guān)基因Atg5后，電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，腎小管上皮細胞內(nèi)存在大量損傷的線粒體、自噬底物p62等，腎臟對缺血性損傷更敏感，腎功能損傷更嚴重[27]。另外，在自噬相關(guān)基因Atg7剔除的小鼠體內(nèi)也出現(xiàn)了相似的結(jié)果[28]，這些實驗均證實自噬缺乏可加重腎缺血再灌注損傷后的腎功能惡化。Bian等[29]的研究也表明，腎缺血后自噬不足可加重缺血再灌注損傷。在腎移植誘導的大鼠腎缺血再灌注損傷模型中，高壓氧治療可通過激活自噬減輕炎癥損傷，從而發(fā)揮保護作用[30]。而在缺血預處理模型中，通過血清和糖皮質(zhì)激素誘導激酶1/叉頭框蛋白O亞族3a/缺氧誘導因子-1α通路可激活自噬流，發(fā)揮腎臟保護作用[31]。這些研究均提示腎缺血再灌注損傷誘導的自噬可能在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中起到腎保護作用。但自噬保護腎缺血再灌注損傷的關(guān)鍵調(diào)控通路目前尚不清楚。腎缺血再灌注損傷是引起急性腎損傷的主要原因，自噬的激活可為腎組織細胞的存活提供保護機制，并為急性腎損傷的臨床治療提供潛在策略，但關(guān)鍵通路還有待進一步研究。

2.2自噬對腎缺血再灌注損傷的損傷作用 自噬的發(fā)生可能加重腎臟損傷，自噬通量異常或自噬長時間激活可能會破壞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，引起細胞死亡[32-33]。Suzuki等[34]的研究提示，自噬在腎缺血再灌注損傷中可以加重腎組織損傷，而抑制自噬可顯著減少過氧化氫刺激的腎小管上皮細胞乳酸脫氫酶的產(chǎn)生，發(fā)揮腎臟保護作用。大鼠腎缺血再灌注損傷誘導的自噬被抑制后，腎組織細胞色素C和氧自由基的釋放顯著減少，腎功能顯著改善[35]。成纖維細胞生長因子10可通過mTOR途徑抑制過度自噬，并抑制由泛素結(jié)合蛋白核自噬受體SQSTM1(sequestosome 1)/p62介導的炎癥反應，減輕腎缺血再灌注損傷[36]。由此推測，自噬可能在缺血再灌注過程中對腎小管造成損傷。腎缺血再灌注損傷是動態(tài)變化的過程，自噬也隨之變化，造成上述研究差異的原因部分可能與實驗模型中采用的動物、細胞種類不同以及不同研究中缺血再灌注持續(xù)時間、觀察時間點各不相同有關(guān)[37]。因此，未來對腎缺血再灌注損傷中自噬作用及機制的研究應基于對這個變化過程的全面了解，這樣有助于更好地理解自噬在腎缺血再灌注損傷中的作用。

3 自噬在腎缺血再灌注損傷中可能的調(diào)控機制

3.1AMPK-mTOR通路 AMPK和mTOR是兩種營養(yǎng)能量敏感激酶，AMPK受AMP/ATP比值、缺氧、氧化應激等因素調(diào)控[38]。在腎缺血再灌注損傷中，AMPK-mTOR表達活躍，mTOR可以抑制自噬的發(fā)生，是自噬的負性調(diào)控因子，在自噬過程中發(fā)揮核心作用，而AMPK可以通過抑制mTOR來增強自噬[39]。在腎缺血再灌注損傷中，AMPK可間接通過抑制mTOR復合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的活性增強自噬或者直接通過磷酸化及活化ULK1/2調(diào)節(jié)自噬[40]。在體外缺血再灌注腎小管細胞損傷模型中，AMPK誘導的自噬對腎臟具有保護作用[41]。同樣，在腎小管細胞構(gòu)建的缺氧/復氧模型中，用吡格列酮預處理可通過AMPK-mTOR信號通路增強自噬作用，從而保護機體免受缺血再灌注損傷[42]。肝再生增強因子也可通過AMPK/mTOR途徑負向調(diào)節(jié)腎缺血再灌注損傷中的自噬，自噬抑制細胞凋亡，并在氧化應激條件下發(fā)揮腎臟保護作用[43]。因此，AMPK調(diào)節(jié)的mTOR途徑是腎缺血再灌注損傷過程中誘導自噬的一個重要信號通路。

3.2磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)-mTOR通路 PI3K-Akt-mTOR通路可調(diào)控細胞周期、細胞增殖、細胞生長、存活、蛋白質(zhì)合成以及葡萄糖代謝等[44]。mTOR蛋白在PI3K-Akt信號通路的下游，調(diào)控PI3K-Akt可通過mTOR影響自噬的發(fā)生、發(fā)展。在腎臟近端腎小管HK-2細胞中，蛋白酶激活受體2的過表達可通過激活PI3K-Akt-mTOR信號通路抑制自噬，并誘導自噬相關(guān)炎癥反應；同時，通過蛋白酶激活受體2的RNA干擾轉(zhuǎn)染剔除蛋白酶激活受體2可抑制PI3K-Akt-mTOR通路，極大地增加自噬并減輕自噬相關(guān)炎癥反應[45]。研究證實，雷帕霉素及其衍生物可通過抑制PI3K-Akt-mTOR通路激活自噬[46]。但研究中所涉及的自噬激動劑和抑制劑大多為非特異性，具體對哪一種自噬起作用目前尚不清楚，且這些藥物在增強或減弱自噬過程中可能對其他生理過程造成影響。最近的研究認為，mTOR抑制劑雷帕霉素不能預防腎缺血再灌注損傷或順鉑誘導的腎毒性引起的急性腎損傷，因此不可作為自噬相關(guān)腎保護機制的理想模擬物[47]。未來需尋找更具特異性的自噬激動劑和抑制劑進行進一步的研究。

3.3氧化應激相關(guān)作用機制 正常情況下，生物體維持低水平的氧化應激，而病理狀態(tài)下氧化還原穩(wěn)態(tài)的失調(diào)及中性粒細胞的募集致活性氧類(reactive oxygen species，ROS)和活性氮過度生成，進一步導致氧化應激及相關(guān)細胞成分的氧化損傷，而代謝率高的腎近端小管細胞遭受了最嚴重的氧化應激損傷，導致細胞損傷和凋亡(即引起繼發(fā)性損傷)，在腎缺血再灌注損傷中抑制氧化應激反應可減輕腎臟損傷[48]。在腎臟疾病的發(fā)病機制中，氧化應激與自噬流的激活相關(guān)，mTOR是自噬通路的關(guān)鍵信號分子，其活性受PI3K、Akt、AMPK等多條通路調(diào)節(jié)，當ROS過度產(chǎn)生時，自噬可通過PI3K-Akt-mTOR通路啟動[49]；同時，ROS所誘導的自噬也受到AMPK/mTOR通路的調(diào)控[50]。研究證實，ROS還可通過影響AMPK-mTORC1-ULK1通路以及Kelch樣ECH相關(guān)蛋白1/核因子E2相關(guān)因子2系統(tǒng)調(diào)節(jié)自噬[51]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1參與細胞存活、新陳代謝、基因沉默等多種過程，在體內(nèi)腎缺血再灌注損傷模型中發(fā)現(xiàn)，沉默信息調(diào)節(jié)因子1可通過上調(diào)自噬抑制氧化應激，從而降低細胞凋亡，發(fā)揮腎臟保護作用[52]。另外，針對氧化應激產(chǎn)生的活性氮與自噬相關(guān)的研究較少，有研究表明，活性氮調(diào)節(jié)的自噬可能加重缺血再灌注損傷[53]。可能是由于機體在遭受缺血再灌注損傷時產(chǎn)生過量的ROS，引起脂質(zhì)的氧化反應，使細胞內(nèi)線粒體膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等受到損傷，而引發(fā)自噬增強，自噬通過降解受損細胞器及胞內(nèi)異常的蛋白質(zhì)等代謝產(chǎn)物維持細胞穩(wěn)態(tài)，調(diào)控氧化應激、減輕腎臟損傷，發(fā)揮保護作用。

3.4p53途徑 腫瘤抑制基因p53在調(diào)節(jié)細胞凋亡和自噬中發(fā)揮重要作用，生理狀態(tài)下，p53作為四聚體發(fā)揮作用，并且低表達于細胞中，當各種原因使機體處于應激狀態(tài)時，p53轉(zhuǎn)錄活性升高，表達顯著升高，p53根據(jù)其亞細胞定位，對自噬的調(diào)控具有雙重作用，核p53可激活自噬，而胞質(zhì)p53可能具有抗自噬功能[54]。研究證實，p53凋亡刺激蛋白2(apoptosis-stimulating protein two of p53，ASPP2)的下調(diào)可以通過激活自噬，改善腎缺血再灌注損傷誘導的急性腎損傷[55]。p53的轉(zhuǎn)錄活性還通過下調(diào)人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因誘導激酶1(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene-induced kinase 1，PINK1)的轉(zhuǎn)錄而抑制自噬，而PINK1編碼參與線粒體吞噬的關(guān)鍵蛋白[56]。另外，胞質(zhì)p53對細胞自噬的抑制作用還可能受到微RNA(microRNA，miRNA/miR)的調(diào)控，如miR-125b、miR-214等[57]。由于p53涉及體內(nèi)多條代謝途徑，p53對自噬的作用目前仍存在爭議，還有待進一步研究。

3.5miRNA相關(guān)途徑 miRNA是由19～22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，由于其在血液、尿液及其他體液中的穩(wěn)定性，成為各種疾病的新型生物標志物，也是腎缺血再灌注損傷的研究熱點之一。在腎缺血再灌注損傷大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，腎缺血再灌注損傷后血漿中的miR-192水平增加4倍，腎臟中的miR-192水平降低約40%，腎臟中miR-192表達在再灌注后7 d保持在低水平[58]。而小鼠模型中，尿miR-10a和miR-30d濃度與急性腎損傷的嚴重程度呈正相關(guān)[59]。這些研究表明，miRNA與腎缺血再灌注損傷密切相關(guān)。另外，在體內(nèi)及體外腎缺血再灌注損傷研究中均發(fā)現(xiàn)miRNA參與了自噬的調(diào)控[9]。Liu等[60]在通過缺血再灌注建立的急性腎損傷小鼠體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)，小鼠腎缺血再灌注損傷后，miR-34a表達上調(diào)，且miR-34a可以直接與Atg4B的3′非翻譯區(qū)結(jié)合，通過Atg4B靶向調(diào)節(jié)自噬活性，從而加重腎缺血再灌注損傷。同時，研究還發(fā)現(xiàn)，在腎缺血再灌注損傷期間，miR-21水平升高，且miR-21抑制劑預處理可增強LC3Ⅱ和Beclin-1的表達，減輕腎損傷，而miR-21是通過Rab11a靶向抑制腎缺血再灌注損傷中的自噬的[61]。而體外缺氧條件下，在腎臟近端腎小管HK-2細胞中檢測到LC3Ⅱ和Atg16L1表達增加、miR-20a-5p表達降低，并發(fā)現(xiàn)miR-20a-5p通過Atg16L1靶向介導缺氧誘導的自噬[62]。由此可見，miRNA可以作為信號分子參與腎缺血再灌注損傷的病理生理過程，未來miRNA可能成為急性腎損傷潛在的治療靶點。

4 小 結(jié)

自噬與腎臟缺血再灌注損傷密切相關(guān)，闡明腎臟缺血再灌注損傷與自噬相互作用的分子機制以及在自噬途徑中的特定靶點，有助于為預防及治療腎臟缺血再灌注損傷的藥物研發(fā)尋找新的靶點。但目前仍有許多問題亟待解決，如自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究多局限于細胞及動物模型，目前的研究結(jié)果在人的腎臟中是否可以得到相似的結(jié)論尚缺乏臨床實踐。研究者傾向于自噬在急性腎損傷中具有保護作用，但不能簡單地理解為提高自噬就有利于急性腎損傷，其作用機制涉及多條信號通路及作用途徑。另外，自噬在腎臟缺血再灌注損傷中的研究成果如何向臨床轉(zhuǎn)化還需要研究者們繼續(xù)探索。