碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌實驗室檢測的研究

余 林，楊 璐，王玉明

（1.云南大學(xué)附屬醫(yī)院/云南省第二人民醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650000；2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，云南 昆明 650000）

碳青霉烯類藥物是目前臨床治療多重耐藥腸桿菌科細菌引起的感染最有效的藥物之一。因碳青霉烯類抗菌藥物在臨床廣泛使用，碳青霉烯類耐藥的腸桿菌科細菌（carbapenem resistance enterobacteriaceae，CRE）不斷出現(xiàn)和增多，其在全球范圍呈現(xiàn)出快速增長的趨勢[1]，給公共健康帶來了嚴重的威脅。CRE 是指對厄他培南、亞胺培南、美羅培南或多利培南任意一種碳青霉烯類耐藥或產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。CRE 引起的感染具有較高的死亡率，特別是CRE 所導(dǎo)致的侵襲性感染（如血流感染）死亡率可達40%～50%[2]。隨著CRE 感染發(fā)病率的不斷增高，抗菌藥物的選擇和使用越發(fā)困難，特別是一些CRE 菌株出現(xiàn)多重耐藥甚至出現(xiàn)泛耐藥的特征，這使臨床抗感染治療面臨更大的選擇困境[3]。而實驗室能夠迅速精準地檢測出CRE，對于防控耐藥菌株的傳播、指導(dǎo)臨床醫(yī)生用藥等方面具有重要的價值。本文就耐藥機制及表型、基因型以及酶免疫層析技術(shù)三大類CRE 檢測方法作一綜述。

1 CRE 耐藥機制

1.1 產(chǎn)碳青霉烯酶 產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE 最主要的耐藥機制[4]。根據(jù)Ambler 分類，碳青霉烯酶主要分為A、B 和D 三類。A 類碳青霉烯酶包括KPC、GES、IMI、SME 以及SFC 等，最常見的是KPC，其中又以KPC-2 和KPC-3 常見。B 類碳青霉烯酶為金屬酶，主要包括VIM、IMP、NDM、GIM、SPM，最常見的是NDM、VIM 和IMP。D 類碳青霉烯酶又稱為苯唑西林酶（OXA），目前發(fā)現(xiàn)400 余種，腸桿菌科細菌最常見的是OXA-48 及亞型。從酶的類型來看，A 類和D類酶屬于絲氨酸酶，B 類為金屬β-內(nèi)酰胺酶[5]。

1.2 外膜蛋白的缺失或合并產(chǎn)AmpC 酶或ESBLs 細菌 通過改變膜孔蛋白的結(jié)構(gòu)可以降低與抗菌藥物的結(jié)合率，產(chǎn)生這種外膜屏障可以介導(dǎo)腸桿菌科細菌對碳青霉烯類藥物耐藥[6]。并且大部分外膜蛋白缺失的菌株常常產(chǎn)AmpC 酶或ESBLs[7]，二者之間可以產(chǎn)生協(xié)同作用，從而增強細菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥性。

1.3 青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）對碳青霉烯類藥物親和力下降 PBPs 不同位置的突變會導(dǎo)致某些菌株對不同類型的碳青霉烯類藥物產(chǎn)生耐藥。另外，編碼PBP的基因突變也可導(dǎo)致對美羅培南和厄他培南的親和力下降，這也會導(dǎo)致某些菌株對碳青霉烯類藥物的耐藥性增強[8]。

1.4 藥物外排泵的高度表達 通過加入泵抑制劑能夠證明外排泵活性存在，同時也證明存在著其他未知的外排泵導(dǎo)致藥物敏感性的降低[9]。

2 CRE 檢測方法

根據(jù)CRE 定義，臨床上主要通過抗菌藥物敏感性試驗進行CRE 菌株的篩查。藥物敏感性檢測方法主要是KB 紙片擴散法測量抑菌環(huán)直徑和最低抑菌濃度（MIC）測定[10]。此方法最為簡單，臨床微生物實驗室最常使用，但該方法無法分辨耐藥的類型，仍然需要通過表型檢測來分析待測菌株對碳青霉烯類的耐藥性以及是否產(chǎn)碳青霉烯酶，或者可以通過分子生物學(xué)技術(shù)確定菌株相應(yīng)的耐藥酶基因。

2.1 耐藥表型檢測方法

2.1.1 Carba NP 試驗（CNP）CNP 試驗是CLSI 在2015 年推薦檢測腸桿菌科和銅綠假單胞菌產(chǎn)碳青霉烯酶的方法。CNP 試驗檢測碳青霉烯酶的特異度和靈敏度都超過了90%[11]，且操作簡單快速，適合臨床實驗室開展，但是仍然存在自制試劑效期短以及無法檢測OXA 型碳青霉烯酶等問題。

2.1.2 改良碳青霉烯滅活試驗（mCIM）和EDTA 改良碳青霉烯滅活試驗（eCIM）mCIM 是CLSI 在2017年推薦檢測腸桿菌科和銅綠假單胞菌產(chǎn)碳青霉烯酶的方法，2018 年又加入了eCIM，兩種方法聯(lián)合使用可以用來區(qū)分絲氨酸碳青霉烯酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶[12]。mCIM 檢測碳青霉烯酶的特異度和靈敏度都超過了97%且容易操作[13]，聯(lián)合eCIM 還能夠區(qū)分絲氨酸酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶[14]，針對性指導(dǎo)臨床使用抗生素，故適用于臨床微生物實驗室使用，但是也存在著耗時長的問題。

2.1.3 碳青霉烯酶抑制劑增強試驗 根據(jù)3-氨基苯硼酸（APB）能夠抑制A 類絲氨酸酶，EDTA 能夠抑制B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶的原理，可以用APB 和EDTA 來對CRE 進行檢測和分類。此方法檢測A 類絲氨酸酶和金屬β-內(nèi)酰胺酶的特異度和靈敏度都超過96%，特別對于單產(chǎn)酶的靈敏度可達100%[15]。碳青霉烯酶抑制劑增強試驗具有操作簡單，可檢測單產(chǎn)A 類絲氨酸酶或金屬β-內(nèi)酰胺酶以及同時產(chǎn)酶的特點，故適合臨床微生物室常規(guī)使用。

但上述方法不能檢測產(chǎn)D 類OXA-48 型酶，針對這一情況，Tsakris A 等[15]報道了一種改進的試驗方法，其將亞胺培南貼于刷有0.5 麥氏濁度的大腸埃希菌ATCC25922MH 平板中央，左右兩邊貼含有待測細菌的紙片，左側(cè)滴加EDTA，右側(cè)滴加EDTA和APB，孵育18～20 h 后觀察結(jié)果。這種改進后的方法特異度和靈敏度都超過96%[16]，可作為補充方法測定產(chǎn)D 類OXA-48 型酶，適合臨床實驗室常規(guī)使用，仍存在需購買特殊試劑和孵育時間長的缺點。

2.1.4 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）MALDI-TOF MS 技術(shù)通過離子質(zhì)量電荷之比與離子飛行時間成正比的檢測原理，測定待測菌的分子量來進行鑒定。近幾年，隨著飛行質(zhì)譜在臨床微生物實驗室的投入與使用，MALDI-TOF MS 在細菌耐藥性檢測方面的能力越來越得到重視。此方法的特異度為97.9%，靈敏度為96.7%[17]，檢測快速，但目前沒有統(tǒng)一操作方法且質(zhì)譜儀價格昂貴，無法標準化，故不適合臨床實驗室常規(guī)使用。

2.2 基因型檢測方法

2.2.1 PCR 法 PCR 法是檢測碳青霉烯酶的金標準，但傳統(tǒng)PCR 方法操作繁瑣以及通量低，近年來基于PCR 檢測原理提出了實時熒光PCR（qPCR）和多重PCR（mPCR）的方法。qPCR 是通過比較標準品與待測樣品的熒光信號來準確定量的方法[19]，常見的有GeneXpertCarba-R、Filmarray 血流感染或肺炎檢測試劑盒、Verigene 革蘭陰性菌血培養(yǎng)鑒定試劑盒等方法對最常見的碳青霉烯酶包括KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48 進行基因檢測，特異度和靈敏度可達96%以上[18]。mPCR 是通過將多對特異引物加入到一個反應(yīng)體系中來進行多種目的基因檢測的方法[19]。mPCR 可準確快速地對臨床標本中主要的碳青霉烯酶基因OXA-48、VIM、IMP、NDM、KPC 進行檢測。PCR 法都具有高特異度和靈敏度的特點，缺點是需要特殊儀器設(shè)備，不適合臨床微生物實驗室使用。

2.2.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法（LAMP）LAMP 是利用聚合酶擴增基因BST，以SYBR 為指示劑檢測KPC、NDM、IMP、VIM 基因，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)[20]，其結(jié)果與傳統(tǒng)PCR 方法完全一致。此方法結(jié)果判讀肉眼可見，反應(yīng)時間短，具有高靈敏性，但目前并未規(guī)范化統(tǒng)一應(yīng)用于臨床。

2.2.3 基因芯片 基因芯片是利用雜交測序的原理將已知序列的基因探針按順序固定，通過與待測樣本雜交后采集標記信號來進行分析的方法[19]。基因芯片不僅可以進行各種微生物的鑒定，也可以用于細菌耐藥基因的檢測，它能直接測定產(chǎn)酶菌株，顯著縮短檢測周期[21]。但就目前而言，基因芯片各方面要求更高，也不能常規(guī)應(yīng)用于臨床微生物實驗室。

2.2.4 二代測序（NGS）NGS 是一種全基因組的測序方法，具有高解析度、輸出量的特征。NGS 功能強大，不僅可以測定所有碳青霉烯酶基因，還可以發(fā)現(xiàn)其他非產(chǎn)酶的耐藥機制[22]。該方法具有全面、快速、高效的特點，但因價格昂貴、技術(shù)要求更高等原因，開展更是受到更多限制，可能對于高端科研機構(gòu)更適宜開展。

2.3 酶免疫層析技術(shù) 酶免疫層析技術(shù)是一種利用抗體介導(dǎo)檢測產(chǎn)酶的免疫學(xué)方法。它通過CHLBs 免疫小鼠來獲得單克隆抗體，利用抗原抗體特異性反應(yīng)原理來檢測待測細菌的碳青霉烯酶，特異度和靈敏度可達到100%[23]。此方法具有操作省時且快速準確，但只能對目標酶型進行檢測，試劑成本高，仍然存在一定的局限性。

3 總結(jié)

從報告的結(jié)果而言，CNP 和MALDI-TOF MS 僅能夠報告是否產(chǎn)碳青霉烯酶，mCIM、eCIM 和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗可以區(qū)分A 類絲氨酸碳青霉烯酶與B 類金屬β-內(nèi)酰胺酶；對于基因型檢測方法都可直接報告檢測到的碳青霉烯酶基因；對于酶免疫層析技術(shù)僅可以報告幾種常見的碳青霉烯酶基因。從檢測時間而言，MALDI-TOF MS 最快僅需20 min，CNP 需要4～6 h，mCIM、eCIM 和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗都需要過夜孵育觀察結(jié)果；基因型檢測方法所需時間也大多在1 h 左右；酶免疫層析技術(shù)所需時間最短僅15 min。總之，CNP 因需自制試劑以及無法檢測OXA 型碳青霉烯酶不推薦使用，MALDI-TOF MS 雖檢測快速但因需自配抗菌藥物溶液且無標準化操作也不推薦，mCIM、eCIM 和碳青霉烯酶抑制劑增強試驗針對臨床微生物實驗室高度推薦常規(guī)使用；基因型檢測方法快速準確且可測基因型，推薦應(yīng)用于科研；酶免疫層析技術(shù)操作最為簡便且檢測速度最快，希望在不久的將來可以降低試劑成本，擴大靶基因的檢測，從而廣泛應(yīng)用于實驗室。