藥品中N-亞硝胺類基因毒性雜質分析方法研究進展

李昊 耿紅江 管清磊 王其宏

摘要：眾所周知，基因毒性雜質具有突變性和致癌性，會對DNA造成極大的損傷，進而嚴重危害人類的生命健康。此外，自“纈沙坦事件”后，N-亞硝胺類基因毒性雜質成為了業界內的研究熱點。本文介紹了在藥品領域的N-亞硝胺類基因毒性雜質分析方法研究進展，主要包括前處理方法和定量方法，旨在為廣大研究者針對藥品基質中N-亞硝胺類化合物的分析方法選擇、開發和驗證提供思路。

關鍵詞：基因毒性雜質;N-亞硝胺;分析方法;研究進展

【中圖分類號】R97 ? ? ? ? ? ? 【文獻標識碼】A ? ? ? ? ? ? 【文章編號】2107-2306（2021）0910--02

1.研究背景

基因毒性雜質也被稱作遺傳毒性雜質，是指能夠直接或間接損傷細胞DNA，并導致基因突變和可能引發癌變的化合物。N-亞硝胺是指亞硝基的氮原子與氨基中的氮原子相連，并在氨基上發生取代反應而生成的一類化合物。此類化合物已被多項報道證明具有強突變性、強致癌性和高毒性，必須嚴格控制。

N-亞硝胺類化合物的結構通式為R2（R1）N-N=O，主要結構類型有7種：N-亞硝基二甲胺（NDMA）、N-亞硝基二乙胺（NDEA）、N- 亞硝基二丙胺（NDPA）、N-亞硝基二丁胺（NDBA）、N-亞硝基二異丙胺（NDIPA）、N-亞硝基乙基異丙胺（NEIPA）和N-硝基-N-甲基-4-氨基丁酸（NMBA）。N-亞硝胺類化合物具有多種生成方式，主要包括仲胺類化合物與亞硝酸之間的相互作用，叔胺類化合物與一氯胺之間的親核取代反應，溶劑N，N-二甲基甲酰胺（DMF）的氧化，橡膠硫化劑與空氣中氮氧化合物相互作用和藥物在存儲或運輸過程中不穩定基團（如二甲氨基）的降解。

自2018 年7 月華海藥業在纈沙坦原料藥中檢測出微量的NDMA，并觸發了歐盟審查和導致大量原料藥在國內外被召回后，N-亞硝胺類雜質就在藥學領域受到了廣泛關注。近三年內，越來越多的藥物中被檢測出此類雜質：2018年10月，EMA報道：印度的兩家藥企Hetero Labs和Aurobindo Pharma 生產的部分沙坦類藥物中也含有NDEA和NMBA，因此，EMA 將審查范圍擴大至所有沙坦類藥物。后來，在其他類藥物中也陸續發現了N-亞硝胺類雜質：2019 年9 月到2020年4月，FDA 報道先后在雷尼替丁和二甲雙胍 中檢測出NDMA。2020年4月，FDA 發布公告：召回美國市場上雷尼替丁產品，該公告中提到某些產品中的NDMA 含量會隨著時間推移而有所增加，進而可能導致雜質含量高于可接受水平。同月，Amneal Pharmaceuticals 的3批尼扎替丁口服液中NDMA含量超過可接受水平，因此公司將該3批產品召回。截至目前，EMA 已將N-亞硝胺類雜質的審查品種擴大至7 種，也就是上述提到的7種。按照目前的發展趨勢，未來可能還會有更多的藥物被檢出此類雜質，因此藥品行業各方必須給予高度重視。

2.分析方法

N-亞硝胺類雜質廣泛存在于熏烤和腌制食品、化妝品、污水及煙草中，因此在這些領域的研究比較成熟，但是在藥品領域關于此類雜質的研究報道卻比較少[1]。盡管在上世紀70年代針對藥品中的N-亞硝胺類化合物的研究就已經開展，然而之后的三十多年則進展緩慢[2]。直至2018年“纈沙坦事件”后，隨著各國藥監部門對N-亞硝胺類雜質越來越重視，對于此類雜質的多種分析方法也被陸續發布。分析方法包括兩部分：前處理方法和定量方法。前處理方法包括用溶劑直接溶解、過濾、離心、萃取等;定量方法常見的有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）以及色譜-質譜（MS）連用法，如GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS、LC-MS/MS，此外還有熱能分析法（TEA）、紫外光譜法（UV）等。

2.1 氣相色譜法（GC）

N-亞硝胺類化合物大多揮發性較好，極性較大，因此GC法通常作為檢測此類化合物的首選方法，也是最早被發現的方法[3]。GC 的進樣方式包括直接進樣和頂空進樣（HS）：前者更適合高沸點和熱穩定性強的物質，但基質污染較大，前處理過程往往較復雜;后者的前處理過程較簡單，基質污染少，但是對于不易揮發、高沸點和熱穩定性強的物質不太適用。分析N-亞硝胺類化合物，直接進樣常用溶劑為低沸點溶劑，如二氯甲烷（DCM）、乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）;而頂空進樣常用溶劑為高沸點溶劑，如N-甲基吡咯烷酮（NMP）、二甲基亞砜（DMSO）。

早在40年前，有研究者就用GC-TEA法對含氨基拉明、二硫磷和土霉素的藥物進行N-亞硝胺類化合物的檢測[3] 。結果表明，在幾乎所有藥物中均檢測到NDMA，最低檢測限可達1μg·kg-1。咸瑞卿等[4]建立了一種用GC-TEA檢測纈沙坦原料藥及制劑中NDMA含量的方法，結果證明，該方法專屬性強，線性范圍寬至10～1000ng·mL-1，檢測限低至3ng·mL-1，回收率為94%～100%。GC-TEA法作為最早被報道的方法，雖然分析N-亞硝胺類化合物專屬性較強，但TEA檢測器價格較昂貴，應用范圍相對較窄，因此未能得到廣泛應用。

2.2 氣相色譜-質譜聯用法（GC-MS）

GC-MS法目前在測定N-亞硝胺類化合物方面得到了較為廣泛的應用，該法利用了質譜儀的準確、快速、靈敏度和分辨率高等優點進行定性和定量分析。GC-MS的離子源類型主要有電子轟擊離子源（EI）和化學電離源（CI）兩種，分析器主要是單四極桿（MS）和三重四極桿（MS/MS），一般情況下，三重四極桿可降低基質干擾（共流出物的碎片或同位素峰）引起的假陽性的發生率，因此三重四極桿的靈敏度和準確度更高。

李俊等人[5]報道了用GC-MS直接進樣法測定坎地沙坦酯中微量NDMA和NDEA。他們在前處理時先用0.2mol.L-1氫氧化鈉溶液溶解樣品，然后用乙酸乙酯進行萃取，盡管在樣品中檢出環己醇，但是對NDMA和NDEA的測試沒有干擾。結果表明，NDMA和NDEA定量限分別為0.06μg.g-1和0.03μg.g-1;NDMA和NDEA的平均回收率分別為88.7%和89.2%，證明該方法準確度好，靈敏度高，簡便可靠，最重要的是前處理方式減小了基質干擾。另外，姜俊等人[6]采用HS-GC-MS來減少基質干擾：他們在測定厄貝沙坦中NDMA和NDEA時，以NMP溶解樣品后通過頂空進樣方式進行測試，此方法有效地避免了直接進樣時高濃度基質組分對色譜柱和氣化室的污染，也減少了基質對待測物測定的干擾。測試結果表明，NDMA 和 NDEA 在 10～500ng /mL濃度范圍內線性關系良好;NDMA和 NDEA的 定量限分別為5.18ng/ml和13.74ng/ml;NDMA回收率在103.5～104.6%，NDEA回收率在100.6～103.2%。說明該方法能夠有效地檢測厄貝沙坦原料藥中 NDMA 和 NDEA 的含量。

除了沙坦類藥物，有的研究者們同樣用GC-MS法在其余藥物中也檢出N-亞硝胺類雜質。文松松等人[7]建立了GC-MS 法測定鹽酸二甲雙胍原料藥及制劑中痕量NDMA。他們直接以二氯甲烷作為提取溶劑，提取時間為30min。結果顯示，NDMA 的定量限為0.5ng/ml ;回收率為93.2%～97.9%;重復性低于7%。以上結果說明本方法靈敏度高、結果準確且重現性好。蔡英杰等人[8]采用GC-MS 法測定頭孢呋辛鈉中NDMA 和NDEA。他們以乙腈溶解、振蕩、離心后取上清液進行測試。結果表明，NDMA 和NDEA 的定量限分別為0. 12μg/mL 和0. 04μg/mL;回收率為101. 7%～106. 3%。該方法操作簡單，能夠有效地檢測頭孢呋辛鈉中這兩種雜質的含量。

2.3 液相色譜法（LC）

采用液相色譜法（LC）分析N-亞硝胺類雜質，關于這方面的報道比較少，主要原因是LC法適用的雜質限度通常在100ppm以上，但是各國藥品監管部門普遍對N-亞硝胺類雜質限度要求及其嚴格，目前EMA 和FDA 對N-亞硝胺類雜質要求不得超過30ppb。因此，LC法的靈敏度不足限制了其在基因毒性雜質領域內的應用。各國藥品監管部門中，只有法國國家藥品和保健品安全管理局發布了HPLC-UV法檢測纈沙坦原料藥及制劑中NDMA。

2.4 液相色譜- 質譜聯用法（LC-MS）

液相色譜- 質譜聯用技術（LC-MS）具有高靈敏度、高分辨力、快速分析、結果準確的特點，能夠滿足痕量毒性雜質測試的要求。此方法已逐步取代LC法用于痕量雜質的分析，在基因毒性雜質領域（尤其是揮發性和熱穩定性較差的雜質）應用較廣泛。另外，LC-MS法相對GC-MS法靈敏度更高，離子源和分析器種類也更多。離子源最常用的是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學電離源（APCI）;分析器除了單四極桿（MS）和三重四極桿（MS/MS）外，還包括飛行時間分析器（TOF）、軌道阱（Orbitrap）和離子阱（Iontrap）等。目前應用最廣泛的分析方法是LC-MS/MS，尤其是對于限度較低（<1 ppm）的雜質而言，此法是最合適的，因為LC-MS/MS 方法可降低基質干擾造成的假陰性（離子抑制）或假陽性（共流出物或同位素干擾）發生可能性，可以滿足較嚴格的靈敏度、專屬性和準確度要求。

研究者們在近三年內陸續報道了用LC-MS法測定各種藥物中N-亞硝胺類雜質。陳鴻玉等人[9]采用超高效液相色譜-大氣壓化學電離-三重四極桿質譜聯用法（ UPLC-APCI-MS/MS） 測定鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA。他們用甲醇溶解樣品，而后經振搖、離心和過濾，最后取上清液進行測試。測試模式為正離子多反應監測（MRM）模式。結果表明，在1～500 ng·ml-1 范圍內線性關系良好;回收率在99. 7%～103. 7% ;定量限為1ng·ml-1。因此該方法專屬性好、線性范圍寬且線性關系良好、準確度和靈敏度都高、操作簡單，可以較好地滿足雷尼替丁膠囊中NDMA 的分析檢測。章為等人[10]同樣用UPLC-APCI-MS/MS 法測定二甲雙胍格列吡嗪片中NDMA含量。他們直接用水做提取劑，其他前處理過程與上述測定鹽酸雷尼替丁膠囊中NDMA時相同。測試模式同樣為正離子MRM模式。得到的結果：NDMA 在1.0699 ～106.99ng·ml-1范圍內線性關系良好;回收率在87.9% ～ 90.3%;定量限為0.89ng·ml-1。該方法操作簡便、靈敏度高、準確度好，可用于二甲雙胍格列吡嗪片中NDMA 的測定。

雖然LC-MS法在分析N-亞硝胺類雜質方面已得到廣泛應用，但是大多數被報道的分析方法同時檢測的雜質種類較少，通常少于3種。為解決此問題，袁松等人[11]建立了UPLC-MS/MS法測定奧美沙坦酯中7 種基因毒性雜質：NDMA、 NDEA、NEIPA、NDIPA、NDBA、NMBA、NDPA。他們用甲醇直接溶解樣品并稀釋，定量測試方法采用APCI 離子源正離子掃描和MRM模式。結果顯示，各雜質濃度在1～100 ng/mL 內具有良好線性關系;樣品加標回收率為87%～106%;定量限為0.06～0.65ng/mL。因此該方法靈敏度高、專屬性強、結果準確，可用于定量測定奧美沙坦酯原料藥中7 種N-亞硝胺類雜質，有效地擴充了同時檢測的雜質種類。

LC-MS法在分析N-亞硝胺類雜質方面通常采用四極桿分析器（MS），但是也有研究者開發出利用高分辨質量分析器（TOF、Orbitrap）分析此類雜質的方法：徐文峰等人[12]采用高效液相色譜- 四極桿飛行時間質譜（LC-Q-TOF-MS）測定氯沙坦鉀及其復方制劑中NMBA。他們用加0.1% 甲酸水溶液作為提取劑，質譜采用ESI和正離子掃描模式。結果：NMBA在5～100ng·ml-1范圍內線性關系良好;定量限為2.1 ng·ml-1;平均回收率為89.2%;重復性、溶液穩定性均符合藥典要求。所以本方法可用于氯沙坦鉀及其復方制劑中NMBA 的定量測定。高分辨質量分析器以其超高分辨力和靈敏度以及超快分析速度的優點，今后也許會在分析N-亞硝胺類雜質方面得到越來越多的應用。

3.總結與展望

自從纈沙坦中被檢出NDMA 后，被檢出N-亞硝胺類化合物的藥物范圍不斷擴大，從沙坦類到替丁類、二甲雙胍類……未來可能還會有更多的藥物被檢出此類雜質。如此嚴峻的形勢下，各制藥企業、科研院所、檢測機構以及藥品監管部門對該類基因毒性雜質的控制勢必會越來越重視，定會制定和發布更加科學合理的分析方法及控制策略。為了避免或盡量減少N-亞硝胺類雜質對人類健康帶來的風險，建立便捷、高效、準確、靈敏的分析方法迫在眉睫。但目前在此類雜質分析方法開發方面仍然存在兩大難點：一方面，如何選擇合適的前處理方法，既要盡可能減少N-亞硝胺類化合物的損失，又要盡可能減少基質污染，從而保證測試的穩定性和準確度;另一方面，如何建立通用、簡便、靈敏度和準確度高、穩定性好、成本低的定量方法，以保證該方法可適用于行業內大多數單位。相信隨著研究者們的不斷努力探索，以上兩大難點會逐步得到破解。本文為藥品N-亞硝胺類基因毒性雜質的分析方法開發提供參考，以便更加嚴格控制此類雜質限度，進而保證藥品質量安全。

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