楓香根際叢枝菌根真菌多樣性*

宋 娟 吳祝華 翁行良 趙 邢 楊學祥 唐榮林 曹 兵 巫 昱 沈厚宇 任嘉紅 陳鳳毛

(1.南京林業大學 南方現代林業協同創新中心 南京 210037； 2.江蘇省句容市句容林場 句容 212424；3.長治學院生命科學系 長治 046011)

楓香(Liquidambarformosana)為金縷梅科(Hamamelidaceae)楓香亞科(Subfam.Liquidambaroideae)楓香屬樹種，是我國重要的闊葉喬木鄉土彩葉樹種,廣泛分布于我國南方各省，在中國18個省(市、區)都有天然分布。在海拔220～2 000 m的丘陵、平原或者山地常綠落葉林中楓香生長迅速，對環境適應性強，是荒山造林、混交造林的優良樹種(胡文杰等， 2018),在我國亞熱帶次生林演替過程中起到重要作用(黃立軍等， 2015)。楓香還具有觀賞、藥用、工業等商用價值(Lietal., 2013; 劉偉等， 2019； 唐生森等， 2020； 洪震等， 2021； 裴云霞等， 2020； 史久洲等， 2020)，人們對它的需求量與日俱增，而人為的過度采集以及生態環境破壞的加劇，致使中國楓香資源蘊藏量和產量都在大幅下降，因此，加強影響楓香產量和質量因素研究十分重要。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)是林地土壤中最普遍、最重要的真菌類群，能與80% 以上的陸生植物共生(Harrison, 2012; Cornejoetal., 2017; Armansyahetal., 2018)。AMF能促進宿主植物對水分及土壤氮、磷、鉀、礦質營養元素的吸收(Philipsetal., 1970)，提高植物對干旱、鹽堿、重金屬等土壤逆性環境及病原真菌、病原線蟲、害蟲等生物逆境的抵御能力(Bradleyetal., 1981; Arocaetal., 2010; Medinaetal., 2010; Ruizlozanoetal., 2012; Wuetal., 2013; Van der Heijdenetal., 2015; Santanderetal., 2019)，從而改善宿主植物的生長狀況。同時，土壤理化因子(土壤pH、有效氮、有效磷和有機質等)、宿主植物和生境異質性均對 AMF 群落結構的形成有重要作用(Kivlinetal., 2011; Davisonetal., 2015; Donetal., 2017; Bonneretal., 2018)。AMF多樣性能夠有效調節植物產量和品質, 而土壤養分變化所導致的AMF群落的變化可能會進一步影響植物生長，進而對整個生態系統產生影響。目前對AM共生的研究仍然較少 (黃京華等， 2018)，任嘉紅等(2008)采用形態法對中國特有樹種南方紅豆杉(Taxuschinensisvar.mairei)，劉輝等(2017)對安徽茶區茶樹(Camelliasinensis)，李一葉等(2003)對長白山赤楊(Alnus)進行AMF多樣性調查。而對于荒山先鋒樹種楓香根際AMF的研究還鮮見報道(宋娟等， 2020)。本研究選擇楓香資源豐富、樹齡構成多樣的安徽、湖北兩省楓香林地為研究對象，應用形態學方法比較研究了20個楓香林區土樣的AMF多樣性及楓香菌根感染狀況； 結合環境因子分析該區域AMF 群落結構的主要影響因素； 通過測定不同樹齡楓香林真菌和根際土壤因子的空間分布，分析“植物 -土壤 -微生物”三者之間的內在聯系，以期為 AMF在安徽、湖北兩省楓香林地生態恢復中的應用提供參考，為楓香人工栽培與生物菌肥的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

湖北設2個樣地： 1)九峰山森林公園(114°34′E, 30°46′N)，地處亞熱帶季風性濕潤氣候區，全年平均氣溫為16.3 ℃，年降雨量1 200～1 400 mm； 2)三角山(115°38′E, 30°36′N)，生物資源豐富，森林茂密，年降雨量882～1 397 mm，夏季最高氣溫28～31 ℃。安徽設3個采樣地： 1)黃山(118°21′E, 30°15′N)，地處亞熱帶季風氣候區，紅壤黃壤地帶，夏季最高氣溫27 ℃，冬季最低氣溫-22 ℃，年均氣溫7.8 ℃，山上全年降水量為2 395 mm； 2)黃山林科院(118°32′E, 29°84′N)，屬亞熱帶季風濕潤氣候，年均氣溫15.5～16.4 ℃，降水量1 395～1 702 mm； 3)稽靈山(118°3′E, 29°7′N)，地處中亞熱帶北緣，年均氣溫 16.3 ℃，降水量為1 670 mm。5個典型地段由自然選擇壓力形成了它們特有的微生物群落，用空間代替時間的方式選取具有特定環境背景的楓香自然林和人工林作為研究對象來設置樣地。樣地各設置10 m × 10 m的樣方，每隔約 6 m 距離，選取長勢良好的楓香，其樹齡范圍在10～100 年進行采樣。采集楓香根系和根際土樣。在每個采樣地點隨機選取4棵楓香，每棵樹樹冠下選4個方位，選取其5～25 cm 深層土樣及根系，采用經典的抖落法收集根際土，輕輕地抖動根系，仍然黏附于根系表面4 mm范圍內的土壤為根際土壤。采集土壤樣品約1 kg，裝入無菌自封袋中，4 h內帶回實驗室，將根系從土壤樣品中撿出，與土壤樣品同樣標示； 根樣用清水洗凈后剪成1 cm長根段置于FAA固定液中固定，土樣風干后裝入塑料袋中于4 ℃冰箱保存。

記錄地形、氣候、土壤類型、土壤質地等(弓明欽等， 1997)，并用地溫計直接測定土壤溫度。

1.2 土壤理化性質分析

將根際 5～25 cm土樣，風干后搗碎過篩，檢測土壤理化性質指標。土壤有機質含量的測定使用重鉻酸鉀容量法——外加熱法測定(NY/T 1121.6-2006)； pH采用電極電位法(鮑士旦， 2000)測定； 過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法(關松蔭， 1986)； 蔗糖酶活性測定采用 3,5-二硝基水楊酸比色法(楊泉女等， 2017)； 土壤含水率采用烘干法測定。

1.3 球囊霉素的測定

按照Wright等(1998)方法測定總球囊霉素(total glomalin, TEG)和易提取球囊霉素(easily extractable glomalin, EEG)含量。

1.4 菌根結構觀察及侵染

楓香根樣用清水洗凈，用潔凈吸水紙吸去水分。將根樣放入錐形瓶中，加入適量的10% (質量分數)KOH，90 ℃水浴加熱30 min。清洗樣品后，加入 5%(體積分數)的乳酸酸化4 min，去掉酸液。錐蟲藍溶液[0.05%(質量分數)錐蟲藍加乳酸酚]染色30 min。將上述已經染色的樣品取出，再用乳酸甘油浸泡多次，直到根樣中多余的染料大部分被清除為止。脫色后的根段制成臨時封片，顯微鏡下觀察根內AMF的(菌絲、叢枝和泡囊等) 結構，并拍照。

1.5 AMF的分離與鑒定

采用濕篩傾析法(Iansonetal., 1986)分離 AMF 孢子。在體視顯微鏡(ZEISS AXIO Imager 2; Zeiss)下記錄孢子數量，按照孢子大小、顏色、表面紋飾、連孢菌絲等特征進行分類，使用ZEISS顯微鏡(ZEISS AXIO Imager M 2; Zeiss)進行壓片觀察。根據Zubek等提出的分類系統，并參閱國際AM菌種保藏中心[International Culture Collection of (Vesicular)Arbuscular Mycorrhizal Fungi, INVAM]提供的種屬的描述及圖片進行，并結合近年來的新記錄種 (http:∥www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp)發布的AMF菌種形態特征信息進行綜合分析研判，對樣本中的AMF種的鑒定，鑒定到屬和種(Blaszkowskietal., 2012)。

AMF種的孢子密度(spore density，SD)為每50克土樣含有的孢子數目； 相對豐度(relative abundance,AR)為某采樣點中AMF某種或屬在該樣本總體中出現的頻度；FRF為某屬或種AMF在樣品總體中的出現率，即FRF=(AMF 某屬或種出現次數/土樣數)×100%； AMF種的豐度(species richness，SR)： 指楓香根際每50 g土壤中AMF種的數目； 重要值(Iv)=(FRF+AR)/2,Iv≥ 50% 為優勢屬或種，10%

AMF孢子密度Shannon多樣性指數(H)，計算公式如下：

H=-∑PilnPi。

式中，Pi=Ni/N，式中Ni表示第i個種的孢子數目，N為群落中AMF孢子的總數。

Simpson多樣性指數計算公式為：

D=1-∑(Pi)2。

均勻度計算公式為：J=H/lnS,S即為物種豐富度指數。

1.6 數據分析

采用SPSS13.0和Microsoft Excel分析數據。使用CANOCO 4.5軟件進行AMF多樣性與土壤理化性質之間的冗余分析(Redundancy analysis，RDA)(ter Braaketal., 2002)。差異顯著性分析利用SPSS13.0中的 ANOVA進行LSD檢驗。樹齡與叢枝菌根真菌多樣性的相關性圖用R(version 3.4.2)制作。

2 結果與分析

2.1 不同樣地土壤理化性質

20個不同楓香林樣地土壤理化性質表現出不同的變化趨勢(表 1)。其中，土壤pH在樣地之間變化不明顯，土樣均呈酸性(pH<7)。土樣的含水率為15.20%～20.20%。土壤過氧化氫酶、土壤有機質含量在20個采樣地之間具有顯著性差異(P< 0.05)(表 1)。安徽黃山的土壤過氧化氫酶活性(2.8 ± 0.03)U· g-1、土壤有機質含量 (2.85 ± 0.01)mg·kg-1均顯著高于其他樣地(表 1)。黃山林科院土樣過氧化氫酶(0.9 ± 0.02 )U· g-1、土壤有機質含量(1.14 ± 0.57)mg·kg-1,均為最低。土壤蔗糖酶在湖北九峰山森林公園顯著高于安徽稽靈山樣地 (P< 0.05)。20個土樣采樣地的土壤蔗糖酶呈顯著性差異(P< 0.05)。

表1 楓香根際土壤理化性質①Tab.1 Soil physical and chemical properties for each of the L. formosana rhizosphere soils sampled

2.2 土樣球囊霉素含量分析

球囊霉素(Glomalin)是AMF的菌絲產生的一種含金屬離子的糖蛋白，不同采樣點楓香根際土壤總球囊霉素含量(T-GRSP)和易提取球囊霉素(EE-GRSP)含量(圖1)可見，樣地間差異不顯著(P>0.05)。采樣地總球囊霉素含量1.01～2.01 mg·g-1，湖北九峰山森林公園采樣地總球囊霉素含量最高(2.01 mg·g-1)，安徽黃山采樣地總球囊霉素含量最低(1.01 mg·g-1)。易提取球囊霉素含量在0.62～0.84 mg·g-1之間，黃山林科院、湖北九峰山森林公園采樣地易提取球囊霉素含量較高，安徽黃山采樣地易提取球囊霉素含量最低(0.62 mg·g-1)。樣地土樣中易提取球囊霉素更易于向總球囊霉素轉化，易提取球囊霉素、總球囊霉素含量變化趨勢相一致。

圖1 不同采樣點楓香根際土壤的球囊霉素含量Fig.1 The glomalin-related soil protein(GRSP) concentrations in the root zone of L. formosana at different sampling sites

2.3 楓香根系 AMF形態特征、侵染狀況和孢子密度

對采集的楓香根樣進行錐蟲藍染色發現， 20個采樣地楓香根部中均有不同程度的 AMF侵染。由圖2可知，AMF菌絲在宿主楓香根系外蔓延生長，形成根外菌絲，根外偶見孢子(圖 2A)； AMF菌絲侵染楓香根系進入皮層細胞內形成根內菌絲并連續二分叉式生長形成叢枝(圖2B、C)； 菌絲多為無隔菌絲，偶有有隔菌絲形成，根內菌絲一部分頂端膨大形成泡囊，泡囊形狀有圓球形、橢圓形、棒形和不規則形(圖2D-F)。以上結構均為AM形成的典型結構。

圖2 楓香根系AMF侵染狀況Fig.2 AMF infection rate of the roots in L. formosanaA： 根外菌絲(Eh)及孢子(S)； B： 根外菌絲(Eh)、根內菌絲(Ih)和叢枝(Ar)； C： 叢枝(Ar)； D、E、F： 泡囊(V)和根內菌絲(Ih)。A: Hyphae(Eh) and spore(S); B: Hyphae(Eh), internal hyphae(Ih) and arbuscule(Ar); C: Arbuscule (Ar); D,E,F: Vesicle(V) and internal hyphae(Ih).

不同采集地楓香根際AMF的孢子密度差異較大，其分布范圍在86～275個·(50 g)-1土，平均孢子密度為166個·(50 g)-1土(圖3)。安徽稽靈山楓香根際AMF的孢子密度最高[275個·(50 g)-1土]，安徽黃山最低[86個·(50 g)-1土](圖3)。各采樣地楓香根樣均被AMF侵染，侵染率范圍在49.43%～73.84%之間，平均侵染率為 62.07%。安徽稽靈山的侵染率最高(73.84%)，湖北九峰山森林公園楓香根樣的侵染率最小(49.43%)(圖3)。楓香根內AMF的叢枝及泡囊較多，表明楓香易被AMF侵染。

圖3 不同采樣點楓香菌根侵染狀況和孢子密度統計Fig.3 Statistics AMF infection rate and spore density at different sampling sites

2.4 AMF和球囊霉素與土壤因子的相關性分析

RDA分析表明： 土壤的5個參數，即土樣過氧化氫酶活性 (U·g-1)、土壤有機質 (mg·kg-1)、土壤蔗糖酶活性 (U·g-1)、土壤球囊霉素含量(mg·g-1)和土壤pH值與采樣點的AMF群落組成、根樣侵染率和AMF的孢子總數相關(圖4)。RDA的前2個軸的特征值分別為0.571和0.066。RDA排序軸總體解釋了67.40% 的物種-環境關系的變化值。土壤過氧化氫酶活性、土壤有機質、土壤pH和土壤蔗糖酶活性對AMF多樣性的影響極為顯著(P< 0.05)。其中，土壤pH和土壤過氧化氫酶對AMF多樣性影響最大，土壤蔗糖酶和總球囊霉素含量呈正相關(R=0.705,P< 0.05)，土樣pH與楓香根系 AMF侵染率呈顯著正相關(R=0.633,P< 0.05)，而土壤總球囊霉素含量和土壤過氧化氫酶活性呈顯著負相關(R=- 0.707,P< 0.05)(圖4)。

圖4 AMF多樣性與土壤因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis(RDA) showed the relationship between AMF diversity and soil factorsCatala： 土樣過氧化氫酶活性； SOC： 土壤有機質含量； Infec： 根侵染率； SpN： 孢子總數； EE-GRSP： 土壤易提取球囊霉素含量； T-GRSP： 土壤總球囊霉素含量； Sosac： 土壤蔗糖酶活性； AS1： 黃山AMF種的豐度 (SR)； AS2： 稽靈山AMF的 (SR)； AS3： 黃山林科院AMF的豐度 (SR)； AS4： 九峰山森林公園AMF的 豐度(SR)； AS5： 武漢三角山AMF的 豐度(SR)。Catala: Catalase activity; SOC: Organic carbon content; Infec: Infection rate; SpN: Spore number; EE-GRSP: Easily extractable glomalin content; T-GRSP: Total glomalin content; Sosac: Soil saccharase content; AS1: AMF species richess in Huangshan, Anhui; AS2: AMF species richess in Jiling Mountain, Anhui Province; AS3: AMF species richess in Huangshan Academy of Forestry; AS4: AMF species richess in Jiufengshan Forest Park, Hubei; AS5: AMF species richess in Wuhan Sanjiao Mountain.

2.5 楓香根際AMF資源的分布狀況

本研究共分離出11屬46種AMF(表2)。其中球囊霉屬 (Glomus)12種，占分離AMF總數的26.09%； 無梗囊霉屬 (Acaulospora)13種，占分離AMF總數的28.26%； 盾巨孢囊霉屬(Scutellospora)5種，占分離AMF總數的10.87%； 巨孢囊霉屬(Gigaspora)2種，占分離AMF總數的4.35% ； 近明囊霉屬(Claroideoglomus)和管孢囊霉屬(Funneliformis)分別為4種，占分離AMF總數的15.38% ； 平囊霉屬(Pacispora)、根生囊霉屬(Rhizophagus)、多樣孢囊霉屬(Diversispora)、隔球囊霉屬(Septoglomus)和兩性囊霉屬(Ambispora)各1種，占分離AMF總數的2.22%。

楓香根際土壤分離到AMF優勢屬有： 無梗囊霉屬、球囊霉屬、盾巨孢囊霉屬、近明囊霉屬和管孢囊霉屬。其中，無梗囊霉屬以蜜色無梗囊霉(A.mellea)、孔窩無梗囊霉(A.foveata)和淺窩無梗囊霉(A.lacunosa)3個種的出現頻率最高(表2)； 球囊霉屬則以黑球囊霉(G.melanosporum)和地球囊霉(G.geosporum)的出現頻率最高； 盾巨孢囊霉屬以群生盾巨孢囊霉(S.gregaria)出現頻率最高(表 2)。這6個種應為楓香根際中AMF的優勢種。

2.6 AMF多樣性分析

不同取樣地楓香根際AMF多樣性指數均存在顯著性差異(P< 0.05)(表3),安徽黃山楓香根際AMF種的豐度為16種·(50 g)-1干土，Shannon指數、Simpson指數和均勻度指數均最小，說明該地區楓香AMF多樣性偏低； 湖北九峰山森林公園取樣地AMF種的豐度為31種·(50 g)-1干土，Shannon指數、Simpson指數和均勻度指數均最大，說明該地區楓香多樣性指數偏高。

2.7 楓香 AMF 多樣性與樹齡的相關性

由圖 5可知，楓香樹樹齡與其AMF的屬數和Shannon指數呈正相關; AMF的屬數和Simpson指數呈顯著正相關(P< 0.05)，而楓香樹樹齡與其AMF種的豐度呈負相關。

3 討 論

楓香為我國重要的觀賞、藥用與經濟樹種，因其是直根系，移栽培育成活率較低，是限制楓香廣泛開發利用的一個瓶頸。選擇有益微生物培育楓香側須根生長，是楓香栽培成功的關鍵技術之一(張玲等， 2013； 宋娟等， 2020)。叢枝菌根真菌(AMF)廣泛分布于自然界中，與植物形成共生體AM后具有促進宿主植物生長、改善作物品質等多種功能(Briccolietal., 2015; Haninetal., 2016; Begumetal., 2019)，但有關AMF與楓香共生的研究仍然較少。筆者從楓香根際土樣中共分離AM真菌11屬46種，根樣侵染率在49.43%～73.84%，平均侵染率為 62.07%，這表明楓香有很高的菌根侵染率，而且真菌物種較豐富。因此，接種AMF來提高楓香的繁殖率具有廣闊的應用前景，AMF將是楓香豐產優質的一種重要的微生物資源。

本研究各采樣土壤中AMF的各屬孢子密度、分離頻度、相對多度、重要值在總體上呈： 球囊霉屬 > 無梗囊霉屬 > 盾巨孢囊霉屬，這種屬的分布特征與施曉峰等(2017)的研究結果一致。各樣地球囊霉屬均占有絕對的優勢，這可能是因為球囊霉屬的高產孢率使其在各種環境條件下均能定殖(Pereiraetal., 2014)，以及其很高的競爭力和適應性，從而使其比別的屬更容易生存。本研究結果也進一步驗證了球囊霉屬在安徽、湖北楓香生長取樣區環境中也具有極強的適應能力。另外，楓香根際蜜色無梗囊霉、孔窩無梗囊霉、淺窩無梗囊霉、黑球囊霉、地球囊霉和群生盾巨孢囊霉分布于所有采樣地的土壤中，在不同樣地都占絕對優勢。這些種可能更適應于在湖北和安徽取樣地楓香根際的環境條件下生存。

表2 不同樣地楓香植物根系AM真菌種類Tab.2 AM fungi species in the roots of L. formosana

續表2 Continued

表3 楓香根際AMF多樣性①Tab.3 The diversity index of AMF in the roots of L. formosana

圖5 AMF多樣性與樹齡之間的相關關系Fig.5 Relationships of AMF community structure with tree ageV1:樹齡； V2:屬數； V3:種的豐度； V4:Shannon指數； V5:Simpson指數； V6： 均勻度； R 值后的“* ”表示顯著相關( P < 0.05)。V1:Tree age; V2:Genus number; V3:Species richness; V4:Shannon; V5:Simpson; V6:Pielou.The “*” after the R value indicates a significant correlation(P < 0.05).

在樹齡和菌根狀況的關系研究上，如Muleta等(2008)調查表明埃塞俄比亞西南部的小粒咖啡(Coffeaarabica) 的真菌孢子密度與樹齡表現隨著樹齡的增加而降低。Song 等(2019) 研究表明安徽瑯琊山瑯琊榆(Ulmuschenmoui) 的菌根侵染率和真菌多樣性隨著樹齡的增加而降低；然而，也有研究報道了AMF豐富度并沒有隨著樹齡的增長而發生顯著性變化(Herrmannetal., 2016)。另外，Dalli等(2020) 研究發現阿爾及利亞西部角豆(Ceratoniasiliqua)樹樹齡≥ 30的菌根侵染率和AMF孢子密度的數值比樹齡 ≤ 10的大。目前，但國內關于樹齡對菌根狀況影響的研究鮮見報道，本研究表明楓香樹齡在(10、 20、 50和100) 范圍內的真菌多樣性隨著樹齡的增加而降低，其原因可能與土壤肥力，尤其是土壤有機質有關。另一個原因可能是幼齡樹根較老齡根系具有較發達的細根(Baddeleyetal., 2005), 幼齡根系大量薄壁細胞、發達的細胞間隙以及較小的表層阻力，更有利于被AMF侵染，形成AMF多樣性。

本研究結果表明，在不同生境條件下植物的生理特征(例如年齡、生長狀況和健康狀況)明顯會影響到AMF群落組成，尤其在植物生長早期，與Bever等(2009)的研究結果相一致。另外，RDA分析表明，楓香根際AMF群落組成與非生物因子： 土壤過氧化氫酶活性、土壤有機質、土壤pH和土壤蔗糖酶活性呈顯著相關(P< 0.05)，說明土壤養分也是影響楓香林土壤AMF的重要因素，這與Guo等(2013)、 Lan等(2017)、Hugoni 等(2018)的研究結果相似。任愛天等(2014) 研究發現新疆石河子綠洲區土壤質地、pH、有機質均對苜蓿(Medicagosativa)根際 AMF分布和多樣性會產生一定的影響； 廖楠(2016) 研究廣西甘蔗(Saccharumofficinarum)根際土壤 AMF多樣性時發現，在赤紅壤中，土壤的 pH 對根系 AMF 物種豐富度有一定的影響。此外, 本研究結果表明土壤pH對楓香根際AMF多樣性影響最大, 土壤pH與AMF種的豐度呈正相關(P< 0.05)。由此可知，AMF種的豐度受pH影響較大。但是，AMF多樣性指數： 屬數(Genus number)、種的豐度 (SR)、Shannon指數、Simpson指數和均勻度數值在5個采樣地呈顯著性差異(P< 0.05)。因此，在相似的年平均溫度和年平均降水量的條件下，推測楓香和地理環境對共生AMF多樣性的選擇起主要篩選作用，該推測結果與劉潤進等(2009)、Hiiesalu等(2014)、Urbanov等(2015)、Muleta等(2008)的研究結果一致。AM 真菌與環境和宿主植物之間的關系密不可分，因此，了解非生物因子與微生物之間的這種相互關系可為揭示植物與微生物之間的互作機制提供參考，并為生產高藥效、高質量的楓香提供新思路。

4 結論

對湖北、安徽兩省20個典型楓香人工林和自然林區楓香根際豐富的、多樣的和特有的AMF物種資源進行調查。分離出 11屬46種AMF，其中球囊霉屬、無梗囊霉屬、盾巨孢囊霉屬為取樣地區楓香根際土壤AM真菌的優勢屬。土壤pH和土壤過氧化氫酶活性對AMF多樣性影響最大。