新一代測序技術在抗癌藥物精準治療中的研究現狀*

陳永孜，楊麗雯，李強，陳駿，王冬園，陳秋月，王卓智，李居怡，鄧艾平，韓勇，呂永寧，張玉

(1.天津醫科大學腫瘤醫院腫瘤細胞生物學實驗室，天津市腫瘤防治重點實驗室，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津 300060；2.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院藥學部，湖北省重大疾病精準用藥醫學研究中心，武漢 430022；3.天津醫科大學生物醫學工程與技術學院，天津 300070；4.武漢市中心醫院，武漢 430024)

癌癥是由細胞基因組變化引起的遺傳疾病，包括點突變、插入突變、缺失突變和染色體易位。隨著研究技術的發展，在癌癥基因組學研究過程中，數據的收集呈爆炸式增長，從而引發癌癥基礎遺傳學研究的變革。在這種情況下，腫瘤生物信息學應運而生，它采用各種生物信息學的方法對大數據包括DNA(基因組)、mRNA(轉錄組)，蛋白質序列(蛋白質組)以及表觀遺傳組學等多組學數據進行分析，從而促進后基因組時代的科學技術進步，促使分子生物學家以一個全新的視角對癌癥的機制進行研究。雖然目前有許多成功的癌癥治療方法，但根據癌癥亞型和疾病階段的不同，許多患者對治療沒有完全反應，或者后期出現耐藥性轉移性疾病。

新一代測序技術是對現代各種測序技術的總稱，又被稱之為高通量測序，用于檢測給定DNA和RNA的核苷酸序列。與第一代測序和Sanger測序相比，新一代測序技術速度快，價格低，因此被廣泛應用于基因組變異檢測、轉錄組分析以及miRNA表達譜等研究中[1-3]。新一代測序技術主要有3種：① Illumina (Solexa) 測序，它是目前世界范圍內應用最為廣泛的新一代測序技術。它主要基于邊合成邊測序的方法，優點為覆蓋度高、速度快、拼接方法簡單，包括MiSeq，HiSeq以及NextSeq等多個系列。② Roche 454，基于焦磷酸測序的方法，比Illumina測序讀長要長一些，單端測序讀長可以達到400 bp，經常用于基因組骨架的組裝。由于454測序技術存在一些缺點，比如無法填補測序缺口和無法準確測量同聚物的長度等，導致很多用戶在實際應用時不會選擇此技術。③ABI SOLID，是基于磁珠的大規模并行克隆連接DNA測序法，它的準確度非常高，但由于系統通量難以提升，且讀長短、成本高，以及拼接復雜，目前也不被廣泛應用。

新一代測序技術在基因組學、轉錄組學、蛋白質組學中的應用，使研究者能夠對各種新的假設進行驗證，從而促進癌癥研究的發展。而這些大規模測序技術的應用也可以獲取大量與特定癌癥相關的基因變異和表達情況，并能夠整合分子特征和臨床特征來預測不同藥物對癌癥治療的反應。在精準醫學的時代背景下，從患者那里收集大量臨床和組學數據，從而找到潛在的藥物靶點，并將結果應用到臨床是當前的主流方向。更為重要的是，這項研究有助于解釋由腫瘤異質性引起的耐藥性。通過將藥物反應數據與表型、基因組學數據以及患者臨床信息相結合，制定個性化的治療策略是精準醫療的主要目的。筆者擬對新一代測序技術在抗癌藥物精準治療中的應用逐一闡述。

1 全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)及其應用

1.1WGS簡介 WGS是癌癥和復雜遺傳性疾病等許多醫學研究項目的主要研究手段。研究人員發現，外顯子以外的DNA變異也會影響基因活動和蛋白質的生成，并導致遺傳性疾病——而全外顯子基因測序則無法捕捉這一變化。WGS通過全自動DNA測序方法和計算機軟件來組裝高通量的序列片段，對個體DNA中所有核苷酸順序進行測定，從而檢測基因組任何部分的變化。研究者可以通過對腫瘤的基因組進行測定，將腫瘤進一步細化成各種亞型，并找到相應的藥物治療靶點。

1.2WGS的應用 目前，WGS已經被用作研究工具廣泛應用到臨床上。特別是對個性化醫療和藥物抗性的檢測，全基因組序列數據都是指導治療干預的一個重要工具。通過臨床試驗，根據患者的基因情況和對藥物的反應來決定藥物試驗的參與者，可以使得新藥開發的成本更低、周期更短。因此，對于一次能夠快速、廉價地為數千個樣本測定數千個單核苷酸多態性(single nucleic acid polymorphism，SNPs)的技術非常受歡迎。隨著人類基因組計劃完成，迄今已發現約1200萬個真正的SNPs。然而，大多數尚未與疾病易感性或藥物反應有關。在需要治療的患者中尋找與藥物反應相關的SNPs，對于個性化治療以及選擇正確的藥物和劑量非常重要。很多制藥公司和研究機構都致力于識別與多基因性狀相關的SNPs，對癌癥進行基因分型以便發現新的治療靶點。目前，已有很多研究通過WGS對SNPs進行測定來發現與藥物治療反應有關的SNPs。比如，NIVEDITHA 等[4]通過對成骨肉瘤的血液細胞進行WGS，從26個與復發有關的基因中發現與藥物反應有關的SNPs。 NASTASE等[5]通過對IIIA期非小細胞肺癌化療患者全基因組數據進行分析，來預測患者是否對誘導化療有所反應，通過確定患者是否含有特定的突變來決定是否進行手術，類似的研究還有三陰性乳腺癌，肺癌和卵巢癌等[6-9]。

2 全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)及其應用

2.1WES簡介 外顯子(基因組的蛋白質編碼區域)在整個基因組中占比<2%，而WES則覆蓋超過95%的外顯子，其中含有與人類疾病表型相關大多數基因變異。WES 使研究人員能夠更高效地利用測序和分析資源，集中研究基因組中最重要的部分，促進常見和稀有變異的發現和驗證。總體來講，WES除了價格比WGS有優勢以外，還具有WGS的許多優勢，可以有效地識別各種變異。

WES可以快速準確對腫瘤及其配對正常組織樣本的外顯子區域進行測定，從而確定每種癌癥類型的癌癥驅動基因。雖然研究者們在癌癥療法方面取得了一定進展，但這一進程仍然比較緩慢。WES在抗癌藥物治療中的應用與WGS基本上是一致的。比如，通過比較藥物反應組和藥物抗性組來發現與藥物敏感性有關的基因突變，SNP和腫瘤突變負荷以及拷貝數變異等[10-13]。雖然這些研究都取得很多進展，但是仍迫切需要強大穩定的生物標志物來預測一些患者對于治療的耐藥性。隨著測序技術的飛速發展和成本的降低，利用基因組信息為患者選擇最有效的治療方案并盡量減少副作用將很快成為現實。

2.2WES的應用 WES的主要應用之一便是腫瘤突變負荷(tumor mutation burden，TMB)，它通常以每百萬腫瘤基因組區域中包含的腫瘤體細胞突變總數來表示，單位為mutations/Mb，可以用來代表蛋白編碼區的非同義突變分布的密度，在生物標志物研究中受到廣泛關注。一般來講，TMB主要針對蛋白編碼區中有可能使腫瘤細胞產生新抗原的非同義突變。TMB越高，其腫瘤細胞中能被免疫系統識別的腫瘤新抗原的數量可能越多，被免疫系統識別的概率越高，免疫檢查點抑制劑激活機體自身的抗腫瘤免疫應答反應后，殺傷這些腫瘤細胞概率越大。一般來講，每兆序列中含有超過10個突變的患者被認為是高腫瘤突變負荷，有些研究也把>20 mutations/Mb認為是高腫瘤突變負荷。目前，最直接有效計算TMB的方法就是WES，然而考慮到實驗周期和成本，也有根據不同靶向基因設計的各種檢測組合(panel)，從而降低成本，然而得到的TMB分值沒有全外顯子得到準確。通過比較患者腫瘤組織和配對正常組織的全外顯子或者靶向測序序列，可以得到腫瘤中體細胞突變的數量，進而計算TMB，再結合統計學方法進行建模，從而對患者預后或者藥物反應進行預測。比如，研究者為TMB分析開發一種新的算法，用于預測檢查點抑制劑免疫療法的反應[14]。而通過分析不同基因或者基因集與TMB的關聯性，尋找與化療或者免疫治療相關的生物標志物，也是非常熱門的研究[14-18]。

3 轉錄組測序及其應用

3.1轉錄組測序 RNA分子在各種生物過程中扮演重要角色，在抗癌藥物的治療研究過程中非常重要。測序是研究RNA非常重要的工具，比如對于信使RNA來講，常用的高通量手段有RNAseq和基因表達譜芯片。而RNAseq與表達譜芯片比較，可以提供更大的測序范圍和更高的靈敏度，同時消除芯片固有的偏差。此外，有研究表明，特定的轉錄本與藥物反應有關，因此，RNAseq在尋找與藥物反應有關的生物標志物時更有優勢。

3.2轉錄組測序的應用 基因表達分析是RNA測序的主要應用之一，已被制藥公司和研究機構廣泛使用，用來檢測SNPs、基因融合和拼接事件等水平。通過二代測序技術對mRNA進行測定首先需要制備mRNA文庫。對于文庫的構建來講，最終目的都是盡可能提高文庫的復雜度。目前，也有很多成熟的商業化試劑盒，用戶可以根據需要來進行選擇。信使RNA測序技術已成為功能基因組學研究中一項非常關鍵的實用技術，它主要通過檢測人類基因組的表達情況，找到兩組患者(藥物敏感和藥物抗性)顯著差異表達基因，通過通路富集分析或者進一步實驗驗證，即可發現與癌癥耐藥有關的基因，及其信號通路等信息[19-20]。

在個性化醫學的發展中，通過RNA測序發現的生物標志物，最終目的是為癌癥患者的診斷、監測和分類提供更高的應用價值。通過RNA測序進行高通量生物標志物篩選后，研究人員通常會進行配套診斷檢測并開發驗證，最后申請藥物監督部門批準。比如，在 2014 年，RIMSZA等[21]發現一個由20個基因組成的表達譜能夠對彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)進行分類。塞爾金公司隨后與NanoString合作，根據研究結果開發配套診斷測試，對參與DLBCL治療的臨床試驗患者進行篩查，最終成功地應用到臨床上。

4 小RNA測序及其研究

小RNA是一類的非編碼RNA分子，長度<200 nt。小RNA的種類包括miRNA、siRNA、piRNA、snoRNA、tsRNA、srRNA和snRNA。這些小RNA在基因沉默和基因表達的轉錄后調節中起著至關重要的作用，涉及許多生物過程，包括細胞增殖、分化以及凋亡。一些研究結果表明，小RNA與癌癥的發生和發展，以及抗腫瘤耐藥性有關。例如，通過miRNA測序分析，研究人員發現miR-17的過度表達與結腸癌的化療抗性有關[22]。miR-34參與胃癌、前列腺癌和乳腺癌耐藥性的調節[23-25]。在腫瘤組織中發現piR-4987、piR-20365、piR-20485 和 piR-20582 的表達水平顯著上調[26]。

一種成功的新藥必須滿足當前的醫療需求，在安全性或療效方面應明顯優于當前的標準。最近的動物和人類試驗數據表明，抗miRNA化合物通過抑制特定miRNA，有可能成為一個全新的藥物類型。此外，miRNA 有幾個顯著的優點，首先它們很小，并且是由已知序列組成，而且在物種之間非常保守，從藥物開發的角度來看，這些優點非常有吸引力。近年來，miRNA測序為鑒定新藥靶點提供了更多的機遇。基于miRNA在疾病狀態中的作用及其在疾病細胞調節中的作用，miRNA的調控在藥物研究中是非常具有潛力的。因此，研究小RNA在腫瘤學中的作用，將促進研究者們對腫瘤病理進展的認識，加速發現新的抗腫瘤療法。

5 免疫組庫測序

對免疫系統的深入了解是現代醫學與治療相關發展的核心。免疫組庫是指在任何時間，某個個體的循環系統中所有功能多樣性B細胞和T細胞的組合。免疫組庫測序主要以T/B淋巴細胞為研究目標，對B細胞受體和T細胞受體的互補決定區進行擴增。該區域包含三個部分，在抗原識別中起著很重要的作用。結合高通量測序技術對此區域的DNA或RNA進行測定，可以全面評估免疫系統的多樣性，深入挖掘免疫組庫與癌癥之間的關系。免疫組庫分析可以在生物醫學研究各個階段對免疫系統進行研究。由于免疫調節藥物旨在改變免疫系統的動態性質，免疫療法往往伴隨嚴重的副作用。通過對免疫組庫測序數據進行分析，將捕獲的信息進一步轉化為預測性生物標志物，以便更好檢測患者免疫檢查點的治療療效。比如，REUBEN等[27]通過免疫組庫測序發現，病灶特有的突變會導致新抗原的內部表達差異，從而改變腫瘤免疫原性，并形成T細胞克隆性差異。T細胞受體的腫瘤內異質性增高與術后疾病復發以及低生存率有關。此外，免疫組庫測序還可以用于癌癥亞型的分類[28]、生物標志物的發現[29]和微小殘留病的檢測[30]等。

6 單細胞測序

不同細胞類型的功能往往是不同的，而具體哪種細胞類型會導致疾病是很多科學家一直致力于解決的問題。以往大多數研究是在整個組織樣本上進行的，這些樣本由數百萬種不同類型和功能混合在一起的細胞組成。雖然這種研究對于比較組織(例如藥物治療之前和之后)的一般特征非常有用，但它們在了解組織內不同細胞類型的特征和反應能力方面非常有限。最近，單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術的進步可以大規模對單個細胞中的基因表達進行深入分析，為探索細胞類型內部和細胞類型之間表達的異質性提供無限可能。它為研究組織中所有細胞的類型和研究單個細胞類型在疾病環境中的表達特征、表達豐度和相互作用方面的變化提供了一個新的機會。而且，scRNA-seq也可以揭示與疾病相關的意外新亞型或功能狀態。在癌癥研究中，對單個細胞的DNA進行測序可以提供各個小細胞群所攜帶的突變信息。而對單個細胞的mRNA進行測序則可以深入了解不同細胞類型的存在和它們的生物學行為。由于腫瘤異質性的存在，單細胞測序可以很好地鑒定不同細胞對不同藥物的反應，從而揭示潛在的分子學機制[31]。它還可以通過對疾病過程和治療干預措施中的新藥靶點進行識別，從而在醫學領域提供尖端應用[32]。

7 結束語

作為一個復雜型疾病，癌癥的治療受到多方面的影響。醫生和科學家們也一直在尋找更好的方法來治療癌癥患者。為此，他們開發并研究新的腫瘤藥物以及尋找新的治療方案來使用已有的藥物。一種新的腫瘤藥物從實驗室到臨床應用是一個漫長的開發和審批過程，而這個過程往往需要很多時間和大量的資源。因此，老藥新用作為一種藥物研發策略，不僅可以縮短研發時間，降低研發成本，還可以減少研發風險，受到越來越多的重視。新一代測序可以對基因組、表觀基因組、轉錄組、蛋白質組以及代謝組數據進行測定，而計算機分析和處理能力的迅速發展和生物信息學的崛起使研究者們能夠從不同的數據中挖掘與癌癥治療藥物有關的生物標志物，進而得到可以穩定應用到臨床中的生物標志物，從而更為精準、系統地揭示不同疾病的分子機制。雖然通過科學家的不懈努力，發現很多可以用于指導藥物治療的生物標志物，然而由于數據的質量和單個研究的數量問題，在應用的時候會產生不穩定的結果。也就是說單個研究發現的生物標志物缺乏可靠的魯棒性(Robustness)。如果研究者們可以將完整的數據，尤其是用藥及其藥物反應等臨床數據進行公開，那么對于發現穩定的生物標志物無疑是非常有幫助的。此外，將多層次的數據進行整合對于抗癌藥物治療效果的研究來說也是一個非常有效的方法。鑒于癌癥的復雜程度，單個基因的突變或者表達有時很難對一種癌癥進行解釋。目前，各種組學的數據都可以通過新一代測序數據獲得，如果將這些數據進行整合分析，相信可以更加深入的了解不同藥物在癌癥治療中的作用。