軟骨細胞周基質及其參與力學信號轉導的研究進展

楊崢，何樂人

(中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院耳再造一中心，北京 100144)

1925年細胞周基質(pericellular matrix，PCM)在軟骨組織中被首次發現[1]，PCM從細胞膜表面向外延伸數微米并環形包繞細胞的基質條帶[2]，廣泛存在于紅細胞、內皮細胞、上皮細胞、軟骨細胞、平滑肌細胞等[3]。PCM的主要成分是富電荷的蛋白多糖，蛋白多糖易于水化、含水量高[4]，在常規組織切片制備過程中蛋白多糖易被破壞，因此在傳統相差顯微鏡和微分干涉顯微鏡下難以觀察PCM[5]，限制了PCM相關研究。隨著紅細胞固定對比顯像、納米視頻增強顯微技術、示蹤速度測量學等觀察和研究方法的改進[3]，人們對于PCM組成、結構和功能的研究逐漸深入，其在細胞內外信號轉導和細胞表面生化活動中發揮的重要作用得到揭示。近年來關于PCM的研究主要集中于腫瘤侵襲轉移[6]、骨與軟骨損傷的修復和再生[4]、心血管疾病[7]等方面，其在細胞運動[8]、細胞分化[6,9]、微環境維持[10]、力學傳導[11]等活動中發揮作用。PCM有助于維持軟骨結構和力學特性，作用涉及軟骨的發育、退化、修復、再生等，提示PCM在軟骨相關疾病中有重要作用[12-14]，可應用于軟骨組織工程[15-16]。現就軟骨PCM組成結構和生物力學相關的研究進展，以及PCM成分、作用及參與力學信號轉導的機制進行綜述。

1 PCM的主要成分

軟骨組織中，PCM與其所包裹的軟骨細胞共同構成軟骨單位[17]。隨著機械法和酶消化法的改進，軟骨單位的分離日益便捷，這為研究PCM奠定了基礎[18]。作為軟骨細胞與細胞外基質的連接成分，PCM位于軟骨細胞與細胞外基質之間，厚度為1～5 μm，在軟骨組織的不同區域，包裹數目不同的同源軟骨細胞群[3,19]。

PCM的主要成分是Ⅵ型膠原和蛋白聚糖[20]。與細胞外基質相比，PCM含有特異性的Ⅵ型膠原[20]，含量更高的基底膜蛋白多糖[21]、蛋白多糖單體或低聚物[22]、透明質酸[23]、二聚糖[24]、Ⅸ型膠原[25]等。組成的差異影響了基質的特性，隨著軟骨細胞空間排列的變化，PCM和細胞外基質的彈性變化并不同步[14]。

1.1Ⅵ型膠原 Ⅵ型膠原是PCM的特異性成分，分布于軟骨組織，常作為軟骨單位和PCM的特有標志物。與其他類型膠原相比，Ⅵ型膠原在結構和功能不同，進而影響著PCM的構成和功能。結構上，Ⅵ型膠原在細胞內組裝為四聚體，無乙醛介導的交聯[26]，通過整合素α3β1和跨膜蛋白多糖神經膠質抗原2錨定在軟骨細胞膜上，形成獨立的網狀結構[27]。功能上，Ⅵ型膠原的存在影響PCM的發育和軟骨組織的生物力學性質，促進軟骨細胞的增殖和組織再生，對軟骨細胞具有炎癥保護作用[28]。在Ⅵ型膠原基因敲除的小鼠中，關節軟骨中PCM形成受阻、剛度降低，骨關節炎進程加快[29]。Smeriglio等[30]的研究發現，培養基中添加Ⅵ型膠原能夠促進軟骨細胞增殖，但將Ⅵ型膠原鋪于培養皿底則無此作用；可溶性Ⅵ型膠原的促增殖作用在骨髓來源的間充質干細胞中亦得到證實[31]，提示Ⅵ型膠原以某種結構形式參與細胞增殖的受體-配體反應。在軟骨組織的不同區域，PCM的形態不同，而在PCM區域，Ⅵ型膠原的分布亦不均一，這種差異性分布與PCM不同區域彈性模量的遞變直接相關[1]。Ⅵ型膠原作為PCM的主要成分，在同一軟骨單位、不同軟骨單位間的含量差異是構成PCM空間分布差異的基礎。

1.2基底膜蛋白多糖 基底膜蛋白多糖是一種大分子硫酸乙酰肝素蛋白多糖，通過HS鏈與Ⅵ型膠原結合，與Ⅵ型膠原共定位于PCM區域[32]。與Ⅵ型膠原分布相同，基底膜蛋白多糖分布呈梯度變化，主要聚集在PCM靠近軟骨細胞的區域[33]。

基底膜蛋白多糖可與纖維連接蛋白和層粘連蛋白相互作用，通過HS鏈傳遞電子[34]，與硫酸乙酰肝素一起作為成纖維細胞生長因子-2(fibroblast growth factor-2，FGF-2)的胞外基質儲備庫，通過釋放FGF-2起到力學傳導作用[35]，基底膜蛋白多糖及其參與的力-化學信號轉導是PCM力學性質的基礎。Wilusz等[33]利用結合免疫熒光標記的原子力顯微鏡檢測發現，PCM中靠近軟骨細胞的內部區域的彈性模量較外周區域低，這一趨勢與基底膜蛋白多糖在PCM內部區域和外周區域的分布差異一致，提示基底膜蛋白多糖參與降低軟骨細胞周圍的彈性模量。Xu等[36]利用原子力顯微鏡檢測小鼠軟骨細胞和周圍基質硬度發現，敲除基底膜蛋白多糖的小鼠軟骨細胞和PCM硬度顯著降低，提示基底膜蛋白多糖在維持軟骨力學性質上不可或缺。基底膜蛋白多糖在PCM不同區域表現出分布差異，進而影響PCM的機械性質，這是PCM傳導力學信號的基礎。

1.3其他成分 近年來利用蛋白組學[37-38]、免疫熒光定位、雙向電泳和質譜分析等技術在PCM中發現了更多成分，包括血管性血友病因子A結構域相關蛋白、三磷酸異構酶、轉化生長因子-β-誘導蛋白、轉化生長因子-β-結合蛋白-2[18]、Ⅺ型膠原[39]等。免疫熒光定位檢測發現以上成分位于PCM區域，與Ⅵ型膠原和基底膜蛋白多糖共同構成PCM，維持軟骨微環境的穩態。

PCM結構和成分的穩定保證了軟骨組織微環境穩態，感知和響應生物力學微環境的擾動，維持基質穩態和細胞間交流[3]。Wilusz和Guilak[40]的研究發現，PCM對于酶的消化有高度抵抗作用，彈性蛋白酶消化部分蛋白聚糖、膠原蛋白后，PCM彈性模量降低24%，而PCM的微機械性能不受軟骨素酶、聚蛋白多糖酶、透明質酸酶消化的影響。de Vries等[41]發現，體外培養的軟骨細胞隨著基質的沉積和增厚，PCM的楊氏模量逐漸增高，相同機械加載條件下細胞變形顯著降低，表明PCM的穩定對軟骨細胞變形有保護作用。另一方面，PCM的組成和結構不是一成不變的。PCM參與軟骨細胞-基質間信號轉導，通過修飾生長因子或其他信號分子作用于軟骨細胞，影響對代謝和刺激信號的反應[42]。此外，PCM的超分子結構也會隨細胞和環境的變化而改變[34]，在細胞分裂和細胞黏附中，蛋白聚糖和透明質酸的分布、類型及空間組織結構隨胞膜形態和細胞形變而改變[43-44]。

體外培養的軟骨細胞中，PCM的組裝積累和重構是軟骨細胞行為的重要部分，PCM的成分及其分布能夠反映軟骨細胞的活力、增殖和代謝等過程，有望成為評價軟骨細胞的新指標，對軟骨細胞檢測和新生軟骨評價有積極意義，在軟骨細胞治療和軟骨組織工程中有著較為廣闊的應用前景。

2 PCM在力學信號轉導中的作用

PCM具有機械傳感特性，能夠調節細胞外基質傳輸的力學信號[3]，完成力學-生化信號轉導。功能上，PCM獨特的結構和功能顯著影響軟骨細胞的微機械環境，PCM作為生物信號和力學信號的過濾器和傳感器，在組成軟骨細胞-基質力學信號轉導中發揮重要作用[18]。

2.1結構基礎 PCM中的Ⅵ型膠原和蛋白聚糖構成多孔多滲的空間網狀結構，水分子、離子填充其中。當軟骨組織受到機械壓力時，PCM中的間隙水滲出，引發蛋白聚糖表觀濃度增加，間隙離子聚集，固定電荷密度和離子濃度瞬時變化，繼而引發局部滲透性改變，完成力學-生化信號的轉導[45]。Hing等[46]研究發現，利用酶溶法和機械分離兩種方法獲取獨立的軟骨單位，當周圍滲透壓改變時，軟骨單位中軟骨細胞表現出的腫脹反應與不含PCM的軟骨細胞不同，提示周圍環境中的機械化學刺激作用于PCM，通過PCM的調制引起軟骨細胞應答，進而影響軟骨組織的生理病理過程。Khoshgoftar等[47]通過構建關節軟骨無限加壓的固體-溶質-離子三相有限元模型發現，在關節軟骨中存在深度依賴的應變場，軟骨細胞剪切應力對PCM和局部細胞外基質的機械性能敏感；在軟骨機械環境變化早期，即使沒有宏觀組織性能的結構變化，PCM和局部細胞外基質的微觀結構改變也會導致軟骨細胞剪切應變增加。與正常軟骨相比，骨關節炎的軟骨組織中PCM剛度降低，其標志成分Ⅵ型膠原和基底膜蛋白多糖出現降解，PCM的變化與軟骨細胞空間結構變化保持一致[13]。超微結構水平下，PCM中膠原纖維調節軟骨細胞機械微環境的作用也得到證實，Korhonen和Herzog[48]證實，軟骨細胞體積對膠原纖維的剛度變化高度敏感，其排列趨勢與軟骨細胞的空間位置有關，提示PCM在軟骨發育和退變中調節機械微環境的重要作用。

PCM的結構基礎是維持軟骨微環境、發揮生物效應的前提，PCM與細胞膜和基質成分相關，Ⅵ型膠原和基底膜-蛋白多糖通過對應受體錨定于細胞膜表面，同時能夠與PCM中的多糖相連，相互溝通，PCM的完整和穩定對發揮力學作用有重要影響。Xu等[36]在敲除基底膜蛋白多糖基因的Schwartz-Jampel綜合征小鼠模型中通過原子力顯微鏡觀察發現，胚胎肱骨中軟骨細胞和軟骨組織的剛度下降，提示在軟骨發育過程中，基底膜蛋白多糖在PCM內外機械信號轉導和細胞內應答中發揮作用，對于正常軟骨力學的維持必不可少。Alexopoulos等[29]在敲除Ⅵ型膠原的小鼠模型中也觀察到類似現象。與之相對應的是，從軟骨組織中分離出的獨立的軟骨細胞(不含PCM)在體外三維培養條件下，隨著PCM組裝和基質沉積，細胞-PCM整體剛度和表面模量逐漸增加[16,49]。

2.2信號轉導 細胞常見的機械刺激受體有細胞表面的整合素、鈣離子通道、原發性纖毛和非選擇性細胞表面通道[50]等。Ⅵ型膠原、基底膜蛋白多糖等結合于軟骨細胞表面，通過跨細胞膜表面受體(如整合素和盤狀區域受體)將機械刺激信號傳至軟骨細胞，引發胞內改變[51]。Zelenski等[52]通過原位測量細胞學行為和基質特性發現，Ⅵ型膠原通過瞬時受體電位香草酸亞型4介導的Ca2+信號參與調節細胞外基質-PCM-軟骨細胞的機械應力及滲透應力的傳導和傳遞，其中Ⅵ型膠原未直接參與物理和化學信號轉導，而是通過瞬時受體電位香草酸亞型4發揮作用。

PCM的網狀結構中儲存著多種類型的生長因子和其他調控分子，作為生長和調控因子庫，在組織受到機械刺激時釋放出生長或調控因子參與生物力學信號轉導。其中具有代表性的是轉化生長因子-β[53]和FGF-2[54]。軟骨組織在受到切割和循環加壓刺激時，隔離在基底膜蛋白多糖硫酸乙酰肝素鏈上的FGF-2釋放，作用于軟骨細胞[55]。FGF-2通過與軟骨細胞表面不同的FGF受體結合，發揮不同的作用，FGF-2促進軟骨分解和抑制軟骨合成的作用主要通過FGF受體1介導，而保護軟骨的作用則通過FGF受體3介導[56-57]。在維持軟骨微環境的動態平衡中，不同受體表達和受體阻滯參與信號傳遞過程，產生信號傳遞和生物反應多樣。此外，Sun等[35]在研究中發現，包括FGF-2在內的成纖維細胞生長因子家族在PCM中的結合和擴散受限于PCM中膠原蛋白和蛋白多糖相互作用，PCM復雜的空間結構保證了黏附和受體結合位點空間分布的獨立性。

PCM中相互作用的高度多樣性為連接細胞-基質和細胞-細胞的動態網絡奠定了基礎，對局部微環境的擾動保持敏感。在機械載荷作用下，PCM通過分離和釋放不同的分子、離子調整PCM結構，將力學信號傳至軟骨細胞。目前，對生物力學信號轉導過程中各類信號分子、釋放機制、傳導通路和調節機制的研究，能夠部分解釋PCM和軟骨細胞的生物學行為、軟骨疾病的病理生理過程[58]，但仍有許多未知和爭議之處，需繼續深入研究。隨著PCM在瞬時受體電位香草酸亞型4相關通路、FGF受體介導的力學傳導過程中的作用逐步揭示，尋找前者的靶向位點以干預軟骨組織的力學性質，進而應用于軟骨相關疾病的治療以及構建新生軟骨領域等逐漸成為可能。

3 結 語

PCM獨特的成分和結構使其在維持軟骨細胞微環境、力學性質和細胞-基質間力學信號轉導中發揮重要作用，維持機械微環境的同時，在生化-力學信號的放大、反饋、調節等方面起著重要作用。

PCM維持軟骨局部微環境穩態，對生化-力學信號反應敏感，在軟骨相關疾病早期其已出現成分和力學性質的顯著改變，研究PCM有助于早期診斷軟骨相關疾病。PCM的高親和網狀結構和生理條件下基質組裝、膠原沉積和組織重構、仿生學的組織構建為軟骨組織工程提供了新思路。調整外源刺激、調節信號分子、選擇性激活信號通路，通過干預軟骨生物-力學信號轉導過程獲得可控的生物力學性質，在軟骨疾病的治療和軟骨組織工程等領域具有廣闊的應用前景。