奧沙利鉑致肝纖維化的機制研究

周洋，王凱，張子謙，劉洋

(1.哈爾濱醫科大學附屬腫瘤醫院影像中心，哈爾濱 150000； 2.哈爾濱醫科大學附屬第四醫院TOF-PET/CT/MR中心，哈爾濱 150001)

奧沙利鉑是進展期結直腸癌臨床治療的一線用藥，其在用藥過程中的不良反應不可忽視，了解奧沙利鉑所致不良反應的發生過程對于相關疾病的診療發展必不可少。奧沙利鉑用于原發腫瘤化療的療效很好，但同時也可導致藥物性肝臟損傷，相關文獻表明，肝竇阻塞綜合征(hepatic sinusoidal obstruction syndrome，HSOS)是奧沙利鉑最常見的不良反應，具體表現為肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)損傷以及肝竇阻塞引起的相關癥狀，最終可進展為肝纖維化甚至肝硬化[1-3]。近年來多項研究發現，受損LSEC與肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)之間存在一系列的生化轉導和機械轉導，通過多條路徑最終激活HSC產生膠原纖維，故可將HSC作為肝纖維化的標志[4-5]。現就奧沙利鉑致肝纖維化的作用機制予以綜述，以期明確病理機制及其重要通路，找出其中的關鍵作用靶點，以為奧沙利鉑導致肝纖維化的早期診斷、精準治療等提供參考。

1 奧沙利鉑引起的HSOS

1.1HSOS HSOS是以受損LSEC為基礎發展形成的一種肝臟血管性疾病。各種原因所致的LESC腫脹、壞死、脫落，導致微血栓形成，進而引起肝竇阻塞、顯著擴張充血等肝內竇性門脈高壓癥狀，病理進展中，伴隨肝板結構破壞、肝細胞壞死，尤其是肝小靜脈壁增厚、纖維化、管腔狹窄甚至閉塞，血竇內、竇周和小葉間靜脈內有大量膠原蛋白沉積。臨床多表現為肝區疼痛、肝大、腹水等，如果未及時干預，可進展為肝纖維化、非門脈性肝硬化甚至肝功能衰竭等一系列不可逆性病變。Rubbia-Brandt等[1]對153例大腸癌肝轉移患者的回顧性分析發現，術前接受以奧沙利鉑為基礎化療治療患者的HSOS患病率高達51%，而未接受化療患者未發生HSOS。HSOS的肝臟病理改變以小葉中心區損傷為主，其特征為不同程度的肝竇擴張、肝細胞萎縮，伴有紅細胞外滲，或伴有部分肝竇周圍纖維化和纖維化性靜脈阻塞。通過免疫組織化學標記LSEC和HSC發現，在嚴重肝竇擴張區域，LSEC表現為“缺失”狀態，HSC則沿擴張肝竇持續存在，與正常肝臟細胞相比，小葉內幾乎所有HSC中的α-平滑肌肌動蛋白表達增強，表明HSC處于激活狀態。通過電子顯微鏡進一步觀察發現，肝竇擴張區域的LSEC形態變圓并發生腫脹，細胞核周圍的染色質凝聚，肝竇內壁的完整性被破壞，紅細胞、血小板等出現外滲[6-7]。此外，病變區域細胞外基質明顯沉積，主要由細小膠原纖維組成[8]。另有報道顯示，肝竇損傷類型與肝竇擴張程度或分級密切相關[9-10]。因此，奧沙利鉑對LSEC的初始毒性損傷會導致肝竇內壁完整性的破壞，隨后LSEC產生細胞因子和炎癥因子[如白細胞介素(interleukin，IL)-6、血小板衍生生長因子(platele derived growth factor，PDGF)、金屬蛋白酶組織抑制因子、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)]，進而激活HSC并增加細胞外基質中纖維蛋白含量，從而改變早期肝臟細胞的微環境；隨著基質沉積，肝竇乃至整個肝臟形狀及硬度均發生改變，而LSEC以及紅細胞脫落與血小板形成栓子，繼而引起肝竇阻塞，肝內血流動力學改變，肝竇擴張進一步加重。

1.2肝竇擴張的原因 HSOS以肝竇擴張為病理基礎。Marzano等[11]認為，肝細胞萎縮、肝竇阻塞、肝竇重塑是肝竇擴張的三大原因，其可能是奧沙利鉑導致肝臟損傷的病理基礎。

1.2.1肝細胞萎縮 肝竇周圍肝細胞萎縮可造成肝竇管腔的擴大。在一系列以奧沙利鉑為基礎化療的小鼠實驗中，Robinson等[12]發現，化療后小鼠均出現肝竇擴張和肝細胞萎縮，且天冬氨酸轉氨酶和丙氨酸轉氨酶均升高，而未進行化療的對照組小鼠無上述變化。此外，臨床也存在類似現象，Soubrane等[2]通過對術后以奧沙利鉑為基礎化療方案的大腸癌肝轉移患者的研究發現，59%的患者出現了嚴重的肝竇損傷；且單因素分析顯示，肝竇損傷與天冬氨酸轉氨酶、丙氨酸轉氨酶的升高相關。通過聚合酶鏈反應和蛋白印跡技術發現，細胞周期蛋白依賴性激酶抑制點p21[Cip1]是奧沙利鉑治療的小鼠肝臟中高度上調的基因之一，其主要在肝竇損傷區域LSEC表達，p21[Cip1]表達增加通常被認為是細胞衰老的標志，該過程以細胞周期停滯在G1期為特征；此外，與細胞衰老相關的組織纖溶酶原激活抑制點纖溶酶原激活物抑制劑1(plasminogen activator inhibitor-1,PAI-1)也有上調[12-14]。p21[Cip1]和PAI-1的表達均受轉錄因子p53的調控[15]，并作為細胞損傷的回應，如DNA損傷或發生氧化應激時，p53發生磷酸化并具備轉錄活性，表明其可能是細胞衰老的原因[12,16]。細胞衰老過程中，發生細胞萎縮、凋亡，細胞體積變小導致肝竇外周支撐作用下降，細胞功能受損導致肝竇調節能力降低，因此肝竇發生擴張性改變。

細胞衰老與多種趨化因子和細胞因子的表達增加有關。基因分析顯示，以奧沙利鉑為基礎化療方案小鼠肝臟中的人類細胞因子IL-8的鼠源同源物即CXC趨化因子配體1上調[12]。據報道，骨髓移植可致HSOS患者血清IL-8水平升高[17]。另有研究發現了以奧沙利鉑為基礎化療方案小鼠肝臟中與衰老反應有關的其他關鍵介質(CXC趨化因子配體2、單核細胞趨化蛋白1和IL-6)的上調[12]。可見，奧沙利鉑毒性引起的炎癥、細胞間旁分泌可影響肝臟細胞萎縮過程。

1.2.2肝竇阻塞 肝竇阻塞由LSEC和紅細胞脫落或肝竇周圍纖維化等原因引起，可導致肝竇內壓力增高、肝竇擴張改變。奧沙利鉑的排泄過程需要谷胱甘肽的參與，造成肝內谷胱甘肽含量下降[18-19]。實驗表明，奧沙利鉑誘導的HSOS小鼠肝內谷胱甘肽水平顯著降低，且與氧化應激反應相關的多種基因(如金屬硫蛋白1、血紅素加氧酶1和超氧化物歧化酶3)的表達均上調，而核轉錄因子紅系2相關因子2及其調節的硫氧還蛋白1的表達水平均降低；進一步加用抗氧化劑后發現，肝竇內皮破壞的發生率降低至25%，且p21[Cip1]和PAI-1的表達降低，核轉錄因子紅系2相關因子2的轉錄活性增高[12-14]。在肝臟內抗氧化劑減少與氧化劑增多的雙重作用下，LSEC以及竇周其他細胞可能更易受損，而受損或凋亡的細胞及細胞碎片將脫落至肝竇內。

此外，在奧沙利鉑誘導小鼠肝臟發生HSOS的過程中，凝血級聯反應激活，血管性血友病因子、組織因子、凝血因子Ⅹ及凝血因子Ⅹa受體蛋白酶激活受體(protease-activated receptor，PAR)-1和PAR-2表達上調，導致血小板在肝竇聚集，為血栓形成提供了必要條件[13]，且該過程與驅動HSOS相關的基質重塑過程具有一致性，凝血級聯反應可能與基質重塑之間形成了串擾，凝血Ⅹa因子通過PAR-1起作用，可將潛伏狀態的轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β轉變為活性形式[12,20]，研究表明，經四氯化碳處理PAR-1基因敲除小鼠的纖維化程度低于野生型[21]。凝血級聯反應的激活與肝細胞的凋亡導致栓子形成，而肝竇周圍局灶性再生增生和纖維化(即肝竇重塑)，使肝竇形態改變，最終導致肝竇阻塞。各種原因所致肝竇阻塞內的血流動力改變均會引起肝竇擴張。

1.2.3肝竇重塑 肝竇重塑與LSEC、HSC及肝細胞密不可分，奧沙利鉑作用于肝臟，引起LSEC的凋亡和再生、肝竇周圍肝細胞的局灶性增生以及HSC的活化，上述變化均可直接或間接引起肝竇血流動力學的改變[22]，最終導致肝竇擴張。IL-6被認為是一種增殖細胞因子，通過非受體型酪氨酸激酶(Janus kinase，JAK)1/信號轉導及轉錄激活因子3(signal transduction and activator of transcription 3，STAT 3)信號轉導途徑在肝再生中起作用[23]。經奧沙利鉑治療后，出現嚴重HSOS伴再生增生小鼠肝臟中的STAT3表達顯著增加，其可能由IL-6介導，表明JAK1/STAT3信號轉導途徑在HSOS發病機制中具有潛在作用[12]。特定JAK抑制劑AG490對JAK1/STAT3信號轉導途徑的抑制作用可阻止HSC的早期激活[24]，從而抑制肝纖維化的發生。

有證據顯示，在基于奧沙利鉑的化療中，肝臟VEGF家族成員表達上調[12,25]。VEGF在HSOS的發病機制中起關鍵作用，研究報道，通過VEGF受體2和細胞分裂周期蛋白42激活內皮細胞，導致c-Jun氨基端激酶磷酸化，隨后MMP-9表達上調[26]。由于貝伐單抗阻斷VEGF可促使LSEC下調MMP的表達，而MMP家族基因在肝纖維化的形成中起重要作用，故針對VEGF-A的單克隆抗體貝伐單抗可降低結直腸癌肝轉移患者HSOS的發生率[3,27]。基因分析顯示，在奧沙利鉑引起HSOS的過程中，IL-6、凝血酶調節蛋白、血管性血友病因子、Ⅲ型膠原(collagen type Ⅲ，COL3)A1、COL3A2、PDGF-A、金屬蛋白酶組織抑制因子-1、MMP-2及VEGF-C等相關基因表達增加[25]。肝竇重塑是在肝細胞萎縮和肝竇阻塞的基礎上發展形成，其中HSC是主要參與者，HSC的激活受到多方面因素的影響，而完整、正常的肝竇是阻止HSC激活的關鍵。

通常TGF-β和PDGF被認為是HSC發生纖維化和增殖的關鍵刺激因素[27]。實驗表明，奧沙利鉑誘導的HSOS小鼠肝臟中的相關膠原基因表達上調，TGF-β和膠原蛋白Ⅰ水平明顯升高，早期肝損傷病理切片僅顯示膠原蛋白沉積，未見明顯肝纖維化改變，提示奧沙利鉑與晚期肝損傷密切相關[12]。PDGF是HSC增殖和活化的主要細胞因子，其亞型PDGF-C和PDGF-D與纖維化和肝癌有關，在肝纖維化的膽管結扎模型中，PDGF-D顯著上調，從而增加了培養激活的HSC增殖以及細胞外基質內膠原蛋白的表達[28]，可能由PDGF磷酸化并通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B途徑促進HSC增殖和活化導致[29]。此外，對VEGF和PDGF信號的雙重抑制可顯著減少肝竇新血管形成(即CD31和VEGF受體2的表達)和新血管的周細胞覆蓋(即α-平滑肌肌動蛋白和PDGF受體β的表達)，可明顯降低門靜脈壓力，抑制肝竇擴張[14,30]。

可見，肝臟細胞萎縮、肝竇阻塞及肝竇重塑并非單一進展過程，三者相互存在、相互作用、共同發展，故患者病情變化復雜。因此，探究LSEC與HSC的關系有助于進一步認識肝纖維的過程。

2 HSOS誘發肝纖維化

肝臟內通過相互作用來調節細胞的生長、增殖、遷移和分化，并保持其正常的細胞表型。 在這個互動網絡中，健康或受損的細胞會成為鄰近細胞的正或負調節劑，包括通過信號傳導、受體-配體復合物、直接或間接接觸等方式。HSC活化是肝臟纖維化的前提，而正常功能的LSEC對于HSC的活化起屏障作用，HSC的活化與LSEC功能的改變息息相關[30-31]。

2.1肝竇內壁完整性的破壞是纖維化發生的重要前提 LSEC是接觸血液成分并形成肝竇屏障的肝細胞群，是肝臟微循環的關鍵調節器，在肝內細胞間串擾中起關鍵作用。肝微脈管系統的損傷激活了HSC的轉分化，使HSC轉變為具有增生性和纖維化性的肌成纖維細胞樣表型[32]。

在奧沙利鉑引起的肝臟損傷事件中，藥物毒性致使LSEC損傷、死亡，肝竇內皮的完整性破壞，引起肝竇周圍一系列的串擾反應，進而導致HSC的活化，如炎癥反應中IL-6可通過gp130/STAT3信號途徑促進HSC的增殖和活化[24]；凝血級聯反應被激活后，凝血因子Ⅹa通過PAR-1可以將TGF-β激活，而既往TGF-β和PDGF被認為是HSC發生纖維化和增殖的關鍵刺激因子。此外，其他與肝纖維化相關的COL3A1、COL3A2、金屬蛋白酶組織抑制因子-1和MMP-2表達的增加也提示了HSC的活化，表明氧化應激反應也參與了肝竇病變的過程[25]。另有研究發現，LSEC上存在可清除膠原纖維的甘露糖受體，肝竇損傷后，LSEC的缺失使膠原蛋白清除受阻，導致細胞外基質沉積、變硬，肝竇周圍形成的這種硬度增加的環境進一步通過機械轉導來激活HSC，使肝臟纖維化進一步發展[4-5,33-34]。LSEC對于阻止HSC的活化至關重要，LSEC的損傷被認為是一系列肝臟病變的起始，由正常LSEC組成的肝竇內皮系統可阻隔藥物毒性對其他肝臟細胞的損傷，在調節肝臟微循環狀態方面至關重要，還在肝纖維化的發展過程中參與細胞外基質內纖維的降解。

2.2LSEC與HSC之間的生化轉導可誘發肝纖維化 HSC的激活是肝纖維化的前提條件，在正常肝臟中，LSEC維持HSC處于非激活狀態的能力是防止肝纖維化的重要條件[30]。LSEC維持HSC非激活狀態的能力通過旁分泌因子實現，正常LSEC的特征性超微結構是篩板組織上的窗孔，當LSEC受損時，由骨髓源性的內皮干細胞殘基進行修復，但是這種修復是不完全的，生成去分化LSEC或毛細血管化LSEC，而毛細血管化LSEC在形態上顯示為這種特征性的超微結構喪失——篩板上窗孔閉合和基底膜的形成[31,35]。而VEGF-內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)-可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase,sGC)-環鳥苷酸(cyclic guanosinc monophosphate，cGMP)途徑中eNOS活性降低引起的繼發反應導致了LSEC的去分化。

血小板反應蛋白1(thrombospondin-1，TSP-1)是在肝纖維化中產生的一種糖蛋白，可調節多種細胞功能。研究發現，TSP-1通過激活CD47和CD36受體抑制sGC、cGMP依賴性蛋白激酶Ⅰ和一氧化氮合酶，具有多個TSP-1重復結構域的血管性血友病因子裂解酶ADAMTS13已被鑒定為CD36的可能配體，去分化LSEC中TSP-1和ADAMTS13蛋白的表達水平明顯上調，進而使LSEC的窗孔功能喪失。TGF-β是促纖維化的細胞因子，當TGF-β信號優先通過活化素受體樣激酶5傳導時，LSEC中TSP-1的表達增加，進而導致LSEC去分化以及HSC的增殖和活化，而當TGF-β信號向活化素受體樣激酶1轉移時，LSEC功能將得到改善，有助于肝臟纖維化的消退以及防止纖維化的進展[35]。由此可見，正常具有“開窗”功能的LSEC通過生化轉導信號作用于HSC，而VEGF-eNOS-sGC-cGMP是上述作用的重要途徑，阻斷該途徑是HSC活化的重要原因之一。

肝素結合性表皮生長因子(heparin-binding epithelial growth factor，HB-EGF)是維持HSC非激活狀態的重要條件，HB-EGF的釋放需要多種金屬蛋白酶的水解切割，實驗證實，在去分化LSEC中，大部分相關金屬蛋白酶下調，且HB-EGF基因敲除小鼠肝纖維化加劇，進一步表明HB-EGF是LSEC維持HSC非激活狀態的必要條件，HB-EGF是HSC活化的抑制劑[35-36]。故認為，VEGF-eNOS-sGC-cGMP途徑引起的肝竇“開窗”與HB-EGF共同維持HSC的靜止狀態，兩者的表達之間存在某種聯系，但可能并不是唯一的作用機制。

2.3LSEC與HSC的機械轉導可導致肝纖維化 肝內細胞處于細胞外基質中，受到多種外界機械力的作用，如纖維蛋白的拉伸力、循環剪切力和肝竇擴張的張力均對肝內細胞功能有重要影響。LSEC損傷后，血管化反應誘導膠原纖維凝結，造成肝臟細胞周圍基質硬度顯著升高，誘導LSEC激活HSC。固定LSEC形態的實驗發現，LSEC分泌的旁分泌因子并不能使HSC活化，即使兩者直接接觸，旁分泌因子也不足以激活HSC，表明LSEC所受機械力對于HSC激活和組織重塑必不可少[4]。因此，除生化轉導途徑外，LSEC與HSC之間的機械轉導在肝纖維化過程中也起到重要作用。

在奧沙利鉑引起的肝竇阻塞、肝竇重構等過程中，一方面，肝竇擴張可形成一種作用于竇周HSC的剪切力；另一方面，肝竇周圍的局灶性再生增生可壓迫肝竇導致形變，對HSC形成一種牽拉力，此外，在早期肝纖維化過程中，肝臟微環境中的纖維蛋白也可牽拉HSC，而肝臟硬度增加促進HSC活化的機制也可能與此有關。這些機械信號在HSC的活化及肝纖維化的進展中至關重要。Simonetto等[37]對HSC進行的拉伸實驗表明，體外施加于HSC的拉伸力可以刺激HSC產生纖維蛋白，通過整合素β1/肌動蛋白依賴性機制促進纖維聚集。此外，敲減LESC中整合素β1基因可以抑制膠原重塑，表明LSEC可以通過整合素受體調節膠原纖維[4]。Martin等[38]發現，HSC中整合素β1的缺失導致了Yes關聯蛋白1的下調，整合素β1/Yes關聯蛋白1信號在介導HSC激活中具有關鍵作用。實驗發現，Yes關聯蛋白1敲低或Yes關聯蛋白1抑制劑在體外可抑制較高硬度培養基條件下介導的HSC活化，并可減少由四氯化碳或膽管結扎引起的小鼠肝纖維化[39]。此外，使用p300抑制劑對轉錄共激活因子p300的破壞同樣消除了較高硬度培養基誘導的HSC激活，從機制上講，由較高硬度培養基介導的RhoA-蛋白激酶B機械信號誘導p300磷酸化，因此p300也啟動了HSC的激活[40]。Liu等[4]通過體外模擬肝臟早期纖維微環境探究LSEC與HSC的相互作用發現，在140～610 Pa硬度的模擬基質上，LSEC形成了毛細血管狀結構，模擬了肝纖維化早期的血管生成，并最終在活化HSC中觀察到盤狀結構域受體(discoidin domain receptor，DDR)2表達水平升高；進一步敲低HSC中DDR2并進行雙向拉伸以替代LSEC的機械力發現，DDR2-KD阻止了拉伸狀態下或早期肝臟纖維微環境中HSC的激活，同時JAK2、磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B的磷酸化水平均降低，HSC中纖維蛋白和α-平滑肌肌動蛋白表達減少。因此，LSEC毛細血管化誘導膠原纖維凝結，膠原重塑產生的力通過激活HSC中的DDR2-JAK2/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B機械信號促進HSC活化。另外，HSC的膜受體DDR2通過與膠原纖維相互作用被激活，也可以促進HSC的增殖和遷移[41]。LSEC與HSC間的機械轉導是近年研究的熱點，除細胞間生化轉導外，細胞間機械轉導對肝纖維化病情進展亦起到重要作用，為肝纖維化的治療提供了新的研究方向。

3 小 結

奧沙利鉑通過損傷LSEC破壞了肝竇內壁的完整性，同時損害了肝竇自身的調節功能，導致以肝竇阻塞、擴張、重構等為主的一系列病理改變的出現，隨后，HSC及其他肝內細胞發生炎癥反應，通過細胞間相互作用激活HSC，而肝臟纖維化又與HSC的活化關系密切。在肝纖維化發生發展過程中，機械轉導和肝臟中的生化信號傳導同時存在，并在串擾的協同作用下，最終導致HSC激活，進而造成肝臟組織微環境改變，使肝纖維化發生，而肝纖維化很可能是導致奧沙利鉑用藥過程中藥物敏感性下降的主要原因，但其具體機制仍需進一步證實。因此，如果將LSEC損傷作為病理改變的起點，HSC活化作為病理改變終點，在上述奧沙利鉑與肝纖維化的作用機制中找到HSC激活途徑的關鍵節點，通過靶向標記進行特異性診斷和干預治療，可能達到早期診斷藥物性肝臟損傷、阻止纖維化發生、提高藥物敏感性、改善患者預后的目的。