視黃酸通路與顱面部器官發育的研究進展

郭佩佩，王長琛，黃鑫，潘博

(中國醫學科學院北京協和醫學院整形外科醫院整形七科，北京 100144)

脊椎動物的顱面部器官發育過程十分復雜，其形態發生包含骨、軟骨、結締組織等不同細胞類型的發育。有研究報道，顱面畸形是人類最常見的出生缺陷之一，1/3的先天性出生缺陷由顱面畸形引起[1]。顱面部畸形主要發生在妊娠前3個月，這是脊柱動物高度保守的發育窗口。多種信號通路和基因，如成纖維細胞生長因子信號通路、音猬因子(sonic hedgehog，SHH)信號通路、骨形態發生蛋白信號通路以及同源異型盒基因(homeobox genes，HOX)、轉錄因子性別決定區Y框相關基因(sex determining region Y-box gene，SOX)等，在神經嵴細胞的誘導、遷移、增殖和分化過程中均發揮至關重要的作用，這些因子任意時間空間的特異性表達失調均會影響細胞的發育，從而影響正常器官形態的形成[2-3]。視黃酸是維生素A的活性代謝產物，通過結合受體調節多個靶基因的表達，以調控神經嵴細胞的發育[4]。視黃酸通路調控紊亂可引起顱面部多種先天性畸形的發生。現就近年來有關視黃酸信號通路與顱神經嵴細胞發育關系的研究進展予以綜述，進一步闡述視黃酸信號通路與顱面部器官發育缺陷的關系，以期為今后的研究提供參考。

1 視黃酸信號通路

視黃酸是維生素A在生物體內的代謝產物。維生素A主要存在于動物性食品(如肉和奶制品)中，橙色蔬菜中的胡蘿卜素也可以被分解為維生素A。根據視黃酸分子結構中極性基團及側鏈的不同，其可分為多種同分異構體，包括全反式視黃酸、9-順式視黃酸、13-順式視黃酸等。全反式視黃酸是體內典型視黃酸通路中的生物學活性形式[5]；9-順式視黃酸也是體內具有生物學活性的形式；13-順式視黃酸又被稱為異維A酸，是皮膚科的常用藥物。視黃酸參與胚胎發育過程中的一系列生理過程，包括細胞增殖、凋亡和分化等，對成體動物的神經、骨骼、血液及免疫系統等穩態的維持有重要影響[4,6-7]。

視黃酸是一種脂溶性分子，在胚胎發生過程中由母體視黃醇產生。母體來源的視黃醇與視黃醇結合蛋白4結合后通過視黃酸誘導蛋白6進入細胞。視黃酸誘導蛋白6是一種膜轉運體，負責結合并運送視黃醇-視黃醇結合蛋白復合體穿過細胞膜進入靶細胞內。被細胞攝取后的視黃醇與細胞內的視黃醇結合蛋白結合后通過兩步反應生成視黃酸[8]。第一步的氧化反應由具有醇脫氫酶活性的酶催化產生視黃醛，此步驟主要通過短鏈脫氫酶家族的酶和中鏈脫氫酶家族的酶參與完成。第二步由視黃醛脫氫酶(retinaldehyde dehydrogenases，RALDH)將視黃醛氧化為視黃酸，這是影響視黃酸合成的限速步驟。共有4種RALDH在視黃酸的合成過程中具有重要作用，其中RALDH1、RALDH2和RALDH3參與全反式視黃酸的合成，而RALDH4參與體內9-順式視黃酸的合成。研究表明，RALDH2是早期脊椎動物胚胎中此步驟的最主要參與者，在胚胎原腸胚時期即可檢測到[9]。細胞內產生的視黃酸主要經歷以下3種不同的生理過程。如果細胞內有細胞色素氧化酶P450家族26亞家族(cytochrome P450 26 subfamily，CYP26)的酶類，視黃酸就會在胞質中被羥基化，形成生物活性較低的極性代謝物，最終從細胞中清除。CYP26A1、CYP26B1和CYP26C1三個成員是體內重要的視黃酸降解酶[5]。RALDH和CYP26分別具有合成和分解視黃酸的作用，并共同調控維持機體內視黃酸的穩態。若細胞中沒有CYP26，視黃酸則進入細胞核，與胞核內的受體結合，觸發靶基因的轉錄激活。視黃酸的核受體包含視黃酸受體(retinoic acid receptor，RAR)和視黃酸Ⅹ受體(retinoid Ⅹ receptor，RXR)[10]。脊柱動物的RAR和RXR均有α、β和γ亞型，每種亞型都有相應的同分異構體，并在不同組織或細胞中發揮作用。全反式視黃酸、13-順式視黃酸可與RAR結合，而9-順式視黃酸則可以與兩種受體結合。RAR和RXR可組成異構二聚體RAR-RXR受體，在缺乏視黃酸的情況下，RAR-RXR受體與靶基因啟動子區域的視黃酸反應元件結合，招募組蛋白脫乙酰基和阻遏蛋白抑制靶基因轉錄；當視黃酸存在時，視黃酸與受體結合并使其構象發生改變，釋放阻遏蛋白并暴露出共激活因子結合位點，促進靶基因的轉錄[11]。一個細胞中產生的視黃酸還可通過旁分泌的方式向鄰近細胞發出信號，介導非細胞自主效應。

2 視黃酸在神經嵴細胞發育中的作用

神經嵴細胞是脊椎動物特有，起源于背側神經管的一組可遷移的多潛能干細胞。顱神經嵴細胞是神經嵴細胞的一個子集，在顱面結構的形成中起重要作用，構成顱面部大多數組織結構的細胞均由顱神經嵴細胞衍生而來，包括神經元細胞、肌成纖維細胞、黑素細胞、膠質細胞、軟骨細胞和骨細胞等[12-13]。顱神經嵴細胞的誘導、遷移、增殖、分化均需要嚴格時空信號網絡的調控，任何涉及調節顱神經嵴細胞行為的信號失調均可能導致顱面畸形的發生。

在原腸胚時期，神經嵴細胞位于神經板邊緣和非神經外胚層之間，通過上皮-間充質轉化在神經溝背側中線聚集形成神經管，并與神經上皮分離[14]。神經嵴細胞的誘導過程需要神經外胚層和非神經外胚層以及下層近軸中胚層之間信號的相互作用。而神經嵴細胞最早的標志物，也是其誘導過程所必需的轉錄因子Gbx2則由包括視黃酸在內的信號分子誘導產生[4,15]。視黃酸還參與脊椎動物神經管發育的前后軸模式的形成。在胚胎原腸胚時期和早期體細胞形成時期，給予胚胎外源性視黃酸可以改變HOX編碼，并干擾神經管前后模式的形成，破壞神經嵴細胞的誘導過程[16-17]。

誘導并進行上皮-間充質轉化后的顱神經嵴細胞可從間腦、中腦和菱腦(又稱后腦)部位沿特定路徑向腹側區域進行廣泛而協調的運動。起源于間腦和中腦前部的顱神經嵴細胞遷移至額鼻突并分化為鼻部、眼部、額骨和一部分上頜結構。敲除視黃酸受體小鼠的神經嵴細胞存活異常，導致不同程度的額骨、上頜骨和蝶骨融合缺陷等面中部發育不全表型出現[18]。視黃酸信號通路還通過對抗成骨因子的調節來調控成骨機制。外源性視黃酸可以改變成骨和破骨細胞之間的平衡，導致顱骨增厚[19]。

成對同源異型結構域蛋白轉錄因子2是哺乳動物眼球發育的調控因子，其蛋白表達是神經嵴細胞正常遷移所必需[20]。在早期遷移的神經嵴細胞中，視黃酸信號通路增加或成對同源異型結構域蛋白轉錄因子2表達下調會導致神經嵴細胞凋亡及遷移的抑制，而抑制視黃酸的生物合成或過表達成對同源異型結構域蛋白轉錄因子2也會干擾神經嵴細胞的遷移，導致眼結構及顱面發育的異常。外源性視黃酸處理胚胎可以改善過表達成對同源異型結構域蛋白轉錄因子2a而引起的神經嵴遷移抑制和細胞凋亡[16]。

起源于中腦后部和菱腦的顱神經嵴細胞遷移到特定的腮弓。成纖維細胞生長因子信號通路和Wnt信號通路通過調控Cyp26的時間和空間表達，使視黃酸在菱腦部位形成一個前后表達不一的濃度梯度，引導著顱神經嵴細胞的遷移[21-22]。鰓弓發育于咽兩側，內側包繞內胚層，外部覆以外胚層的上皮，能夠產生大量的顱面頭頸部結構。位于第一鰓弓的顱神經嵴細胞衍生為面部的上頜和下頜骨。上頜骨的形成依賴于成纖維細胞生長因子8介導的遠端缺失同源盒1的表達[23]，而下頜骨受內皮素-1誘導的遠中缺失同源盒基因5和遠中缺失同源盒基因6的表達調控[24]。神經嵴誘導分層后的外源性視黃酸治療減少了鰓弓內成纖維細胞生長因子8和內皮素-1的表達，從而抑制上下頜骨結構的發育[25-26]。顱神經嵴細胞遷移分化為第二到第四鰓弓的過程由HOX家族基因表達決定，而視黃酸是菱腦中HOX基因的關鍵調控因子。如HOXA2在確定第二鰓弓方面起著至關重要的作用，而第三鰓弓的發育則與HOXA3的水平密切相關[27-28]。HOXA2的敲除或表達下調使第二鰓弓向第一鰓弓轉變，導致舌骨的丟失和第一鰓弓衍生的上下頜結構的重復。妊娠早期HOXA2表達失調會導致外耳道復制和耳廓缺失，而胚胎晚期HOXA2表達失調會導致耳廓位置降低[29]。在原腸胚和早期體細胞形成期間，給予胚胎外源性視黃酸會改變HOX編碼，正常鰓弓結構的形成被破壞，導致神經嵴衍生結構的畸形[30-31]。

3 視黃酸信號通路調節紊亂造成的顱面部發育畸形

胚胎內的視黃酸依賴于母體供應，其濃度的異常降低或升高均會導致胚胎先天性顱面表型的異常。胎兒體內視黃酸濃度的降低會導致小頭畸形、唇裂、腭裂和小眼癥等。而母體攝入過量維生素A或暴露于視黃酸類似物也會導致小耳畸形、眼距過寬、小頜畸形、唇裂和腭裂等。視黃酸水平嚴重異常甚至會導致胚胎死亡。

3.1腭裂 在腭板的發育過程中，過量的視黃酸暴露會導致腭裂的發生。小鼠胚胎發育的第8.5天是顱神經嵴細胞形成及遷移的時期，此時的視黃酸暴露可引起腭裂的發生。與胚胎的其他時期相比，胚胎第8.5天發生視黃酸暴露小鼠的腭裂發生率更高[32]。SHH信號通路的調控在腭突的生長發育模式形成過程中起著至關重要的作用。補充外源性視黃酸的胚胎腹側前腦區域的SHH信號顯著減少，使位于第一鰓弓的顱神經嵴細胞發生凋亡，進而導致腭裂及腭皺襞形態異常的發生。而通過化學激動劑恢復SHH信號可以減少顱神經嵴細胞的凋亡，并降低腭裂的發生率[33-34]。對小鼠腭裂模型的研究表明，在腭上皮細胞和腭突間充質細胞中，SHH信號通路通過抑制視黃酸的活性來維持正常的組織發育。在Shh基因條件性敲除的腭上皮細胞和腭突間充質細胞中，視黃酸降解的生理過程被抑制，導致腭突和腭皺襞的發育異常[11]。另有研究報道，外源性視黃酸可能通過抑制Smad信號通路的激活來影響腭突間充質細胞增殖，導致腭裂的發生[35]。

3.2胎兒酒精譜系障礙 胎兒酒精譜系障礙指因妊娠女性在妊娠期間攝入乙醇而導致胎兒出現的一組解剖畸形和神經發育異常，其顱面部特征表現為上唇薄、人中平滑或長、瞼裂短、鼻梁低等。胎兒酒精綜合征是胎兒酒精譜系障礙疾病中較嚴重的類型，除上述特征性表型外，約60%的胎兒酒精綜合征患兒存在小頭畸形[36-37]。體內的乙醇代謝產物可產生一系列影響胎兒正常發育的作用，如正常DNA甲基化模式改變、微RNA改變、細胞黏附、連接的變化以及多種生長信號轉導分子表達的改變等[38-40]。故推測，乙醇清除和視黃酸生物合成之間的酶競爭是產前乙醇暴露導致面部及小頭畸形的重要原因之一[8]。乙醇的氧化產物乙醛是RALDH2的有效底物。乙醛與視黃醛競爭RALDH2的酶活性區域，從而使視黃醛積累，視黃酸合成減少，最終導致胚胎發育過程中的顱面畸形[36]。在動物實驗中，乙醇暴露母體在補充維生素A或其代謝產物后，其體內視黃酸信號通路相關基因的表達水平部分或全部恢復，在一定程度上防止了胚胎組織器官的發育畸形[41-42]。

3.322q11.2微缺失綜合征 22q11.2微缺失綜合征是人類最常見的一類臨床癥候群，以第22號染色體長臂上1.5 Mb～3 Mb的雜合缺失為遺傳學基礎[43]。22q11.2微缺失綜合征突出的臨床表現包括顱面畸形、先天性心臟病、腭裂、胸腺發育不全、免疫缺陷以及喂養困難、認知、行為缺陷等。TBX1是22q11.2微缺失綜合征最重要的候選基因。在鰓弓的發育過程中，TBX1受到視黃酸的調控。小鼠體內TBX1突變導致RALDH2表達異常及Cyp26表達下調，視黃酸水平升高引起鰓弓發育缺陷，導致顱面和心臟畸形[22]。在胚胎發育中，視黃酸誘導蛋白6表達于多種組織，包括鰓弓上皮。人類視黃酸誘導蛋白6基因突變導致眼部結構缺陷、腭裂、耳畸形等多種顱面器官畸形，并可導致與22q11.2微缺失綜合征相似的表型，如心臟和認知行為發育缺陷等[44]。

3.4CHARGE綜合征 CHARGE綜合征是CHD7基因雜合突變引起的一類先天性多器官畸形綜合征，主要癥狀包括眼畸形、心臟畸形、后鼻孔閉鎖、生長發育遲滯、生殖器發育不全、耳畸形及聽力障礙等[45]。在胚胎發育過程中，視黃酸信號的失調會導致類似于CHARGE綜合征的發育缺陷。而視黃酸生物合成抑制劑可以修復CHD7敲除小鼠的內耳畸形[46]。有研究表明，CHD7作用于視黃酸合成酶RALDH3的上游，可直接調控其表達，而RALDH3基因的缺失可部分挽救CHD7突變小鼠的內耳缺陷表型[47]。

3.5胎兒寨卡綜合征 通過母嬰傳播而引起的先天性寨卡病毒感染會引起胎兒一系列功能和結構的先天缺陷，稱為胎兒寨卡綜合征，包括癲癇發作、先天性攣縮、椎體外系病變、宮內生長發育受限、顱面及小頭畸形等[48]。有學者在寨卡病毒基因組中發現了與視黃酸反應元件一致的序列，并推測這些病毒的罕見序列與細胞核中的RXR-RAR異源二聚體結合，導致視黃酸信號減少，并干擾了胚胎發育期間正常的基因調控，引起胎兒寨卡綜合征中的小頭畸形表型[49]。

4 小 結

脊椎動物顱面器官的發育是一個十分復雜的過程，涉及不同階段、不同空間的多種信號分子與周圍組織間的協調作用。視黃酸信號通路對于胚胎正常發育，特別是顱面部器官的發育具有重要作用。在顱神經嵴細胞誘導、遷移及分化成顱面部各種突起的過程中，視黃酸信號通路的相關分子突變或表達異常均可能阻礙神經嵴細胞的活動，造成顱面組織形態的發育缺陷。目前有關視黃酸通路在顱面器官形態發生過程發揮作用的具體機制的研究仍處于探索階段。