脊髓背角內參與機械性痛覺超敏的神經環路由損傷性質決定

機械性痛覺超敏 (mechanical allodynia) 反應是一種常見的慢性疼痛狀態，即非疼痛機械刺激在損傷后可引起疼痛反應。研究顯示，脊髓背角是外周感覺信號整合的主要部位，也是導致機械性痛覺超敏反應的神經環路信號轉導的關鍵部位。脊髓背角中傳遞機械性痛覺超敏信號的興奮性神經元主要包括生長抑素陽性神經元以及表達鈣結合蛋白 (CR)與蛋白激酶Cγ (PKCγ) 的神經元。敲除上述興奮性神經元可導致炎性損傷與神經損傷誘導的靜態與動態機械性痛覺超敏反應形成缺陷。PKCγ陽性神經元主要分布于脊髓背角II/III層交界，少數分布于I層和III層，被認為是損傷后允許低閾值機械感受信號傳入的“閘門”。最新研究顯示，分布于脊髓背角II-IV層的膽囊收縮素(CCK)陽性神經元也是低閾值機械感受器，與PKCγ陽性神經元高度重合，且在機械性痛覺超敏反應中發揮重要作用。此外，分布于脊髓背角II-IV層的瞬時囊泡谷氨酸轉運體3(tVGLUT3) 陽性神經元以及分布于II層的CR陽性神經元在機械性痛覺超敏反應中同樣發揮重要的作用。本文作者通過藥理學和化學遺傳學方法研究了上述神經元在機械性痛覺超敏反應中的作用，并探討上述神經元的激活是否因損傷性質而異。

首先，本文作者對分布于脊髓背角II層的CR陽性神經元在機械性痛覺超敏反應中的作用進行了研究。結合前期研究結果，CR陽性神經元能夠響應角叉菜膠炎性痛模型中的低閾值機械刺激引起c-Fos（一個公認的疼痛通路激活標志物）顯著上調，而在坐骨神經分支損傷 (SNI) 模型中響應較少，作者提出假說：CR陽性神經元主要傳遞炎性損傷而非神經損傷誘導的機械性痛覺超敏信號。為驗證這一假說，作者首先通過脊髓注射腺相關病毒8 (AAV8) 標記CR陽性神經元以研究其特異性表征。結果顯示，脊髓背角II層的CR陽性神經元與速激肽1 (Tac1)、速激肽2 (Tac2)、胃泌素相關肽 (Grp) 陽性神經元的共表達比例分別為52%、21%、11%，而與PKCγ陽性神經元無共表達。電生理實驗表明，CR陽性神經元中，91%呈現延遲(Delayed)放電模式，9%呈現強直 (Tonic) 放電模式，且100%接收C纖維傳入信號，80%接收Aδ纖維傳入信號，但不接收Aβ纖維傳入信號。CR陽性神經元樹突形態豐富，包括放射狀、垂直狀以及未知類型，有趣的是，CR陽性神經元沿背腹方向明顯拉長呈樹枝狀，提示其突觸連接可能延伸至脊髓背角II層以外。

隨后采用化學遺傳學方法，通過脊髓背角注射AAV8將抑制性受體PSAM-GlyR導入CRcre小鼠，給予PSAM-GlyR的配體PSEM89S能夠急性抑制CR神經元的活性。為驗證CR神經元是否為炎性損傷或神經損傷誘導機械性痛覺超敏所必需，作者建立了多種炎性痛與神經痛模型。在角叉菜膠炎性痛模型中，vonFrey縮爪閾值（靜態疼痛敏化）顯著降低，棉簽擦拭反應性（ 動態疼痛敏化）明顯增加，注射PSEM89S抑制CR神經元活性后，vonFrey縮爪閾值顯著上調，而棉簽擦拭反應性無改變。腳掌注射完全弗氏佐劑(CFA)炎性痛模型中，注射PSEM89S能夠完全逆轉靜態與動態機械性痛覺超敏狀態。而在SNI神經損傷模型中，注射PSEM89S對靜態與動態機械性痛覺超敏狀態均無影響。Brennan切口術后炎性痛模型中，注射PSEM89S能夠完全逆轉靜態與動態機械性痛覺超敏狀態。此外，本文作者還通過皮內注射辣椒素（激活TRPV1）或芥子油（激活TRPA1）建立繼發性機械性痛覺超敏反應模型。令人驚訝的是，注射PSEM89S能夠逆轉芥子油而非辣椒素誘導的機械性痛覺超敏，因為辣椒素模型被認為是一種神經源性炎性痛模型。隨后研究發現，皮內注射芥子油能夠誘導多種炎性介質釋放，而與溶劑組相比，注射辣椒素對炎性介質釋放無影響。結合以上實驗結果，CR陽性神經元主要傳遞炎性損傷而非神經損傷誘導的機械性痛覺超敏信號，且辣椒素誘導的繼發性機械痛覺超敏屬于非CR神經元依賴型。

接下來，對PKCγ陽性神經元在機械性痛覺超敏反應中的作用進行了探討。本文作者前期研究發現，PKCγ陽性神經元響應SNI神經損傷模型而非角叉菜膠炎性痛模型誘導的機械性痛覺超敏，從而促進c-Fos表達，提示PKCγ陽性神經元可能傳遞神經損傷而非炎性損傷誘導的機械性痛覺超敏。為了驗證這一推論，首先通過在PKCγ起始密碼子插入膜結合GFP (mGFP) 標記PKCγ陽性神經元以研究其特異性表征。結果顯示，PKCγ陽性神經元放電模式較CR神經元更豐富，包括強直型 (Tonic,35.7%)，相位型 (Phasic, 28.6%)，延遲型 (Delayed,28.6%)和間歇型 (Gap, 7.1%)。此外，PKCγ陽性神經元能夠接收Aδ、Aβ與C纖維傳入信號，其中絕大多數傳入信號來自于Aδ纖維。PKCγ陽性神經元形態主要呈中央和放射狀，少數呈現垂直狀。

本文作者采用PKCγ KO小鼠或鞘內注射PKCγ選擇性抑制劑tat-gV5-3抑制PKCγ的活性，研究了PKCγ在炎性損傷或神經損傷誘導機械性痛覺超敏中的作用。結果顯示，PKCγ KO或鞘內注射tat-gV5-3對角叉菜膠、CFA炎性痛模型，Brennan切口術后炎性痛模型，芥子油繼發性痛覺超敏模型誘導的機械性痛覺超敏反應均無影響。然而，PKCγ KO或鞘內注射tat-gV5-3均能緩解SNI模型誘導的疼痛超敏反應。此外，鞘內注射tat-gV5-3還能緩解辣椒素誘導的機械性痛覺超敏反應。提示PKCγ本身是神經損傷而非炎性損傷誘導機械性疼痛異常信號傳遞所必需。

為了進一步驗證PKCγ神經元的作用，本文作者通過脊髓背角注射PSAM-GlyR導入PKCγcreERT2小鼠，給予PSAM-GlyR的配體PSEM89S能夠急性抑制PKCγ神經元的活性。結果顯示，CFA炎性痛模型中，注射PSEM89S對vonFrey縮爪閾值及棉簽擦拭反應性均無影響。SNI神經損傷模型中，注射PSEM89S后vonFrey縮爪閾值顯著增加，棉簽擦拭反應性明顯降低。此外，注射PSEM89S還能部分緩解辣椒素誘導的機械性痛覺超敏反應。上述結果首次證明除了PKCγ本身，PKCγ陽性神經元對傳遞神經損傷而非炎性損傷誘導的機械性痛覺超敏信號同樣具有重要的作用。

接著，研究了脊髓背角深層神經元在機械性痛覺超敏反應中的作用。CCK神經元遍布整個脊髓背角，主要集中在II-IV層。通過脊髓注射AAV8標記CCK陽性神經元以研究其特異性表征，結果顯示，標記神經元主要分布于脊髓背角深層(III-IV層)，且與CR或PKCγ陽性神經元均無共表達，其放電模式包括相位型 (Phasic, 67%) 與強直型 (Tonic,33%)，神經元軸突主要向背腹方向延伸。為了進一步驗證CCK神經元的作用，作者通過脊髓背角注射PSAM-GlyR導入CCKcre小鼠。行為學實驗表明，注射PSEM89S能夠顯著緩解炎性痛模型（角叉菜膠與CFA模型）與神經病理性疼痛模型（SNI模型）誘導的靜態及動態機械性痛覺超敏反應，且可緩解角叉菜膠模型引起的熱痛超敏反應，提示位于脊髓背角III-IV層的PKCγ-CCK神經元能夠傳遞炎性損傷以及神經損傷誘導的機械性痛覺超敏信號。

最后，研究了tVGLUT3神經元在機械性痛覺超敏反應中的作用及其與CCK神經元之間的關系。前期研究結果提示，tVGLUT3神經元分布于脊髓背角II-IV層，敲除tVGLUT3神經元后能夠顯著抑制動態而非靜態機械性痛覺超敏反應。通過脊髓注射AAV8標記tVGLUT3陽性神經元，結果顯示標記神經元分布于III-IV層，且與CR或PKCγ陽性神經元均無共表達。作者通過脊髓注射PSAM-GlyR導入tVGLUT3cre小鼠，注射PSEM89S能夠完全逆轉角叉菜膠及SNI模型誘導的機械性動態疼痛超敏反應。為了進一步研究tVGLUT3神經元與CCK神經元之間的關系，作者通過脊髓注射AAV8將EGFP導入tVGLUT3cre小鼠進行標記，10～14天后與探針標記CCK及Maf, Cpne4, Trh（CCK神經元根據基因表達可分為三類：Maf+, Cpne4+, Trh+神經元）的小鼠進行原位雜交，結果顯示大部分EGFP標記的III-IV層tVGLUT3神經元與CCK神經元共表達(81%)，且共表達的CCK神經元主要為Maf陽性CCK神經元 (81%)，少數為Cpne4陽性CCK神經元，但無Trh陽性CCK神經元，提示傳遞神經損傷與炎性損傷誘導的動態機械性痛覺超敏信號的CCK神經元主要由tVGLUT3神經元組成。

綜上所述，雖然炎性損傷與神經損傷誘導的機械性痛覺超敏反應相似，但脊髓背角神經環路的激活卻因損傷性質而異。本研究發現，脊髓背角興奮性神經元對機械性痛覺超敏信號的傳遞至關重要，其中脊髓背角II層的CR神經元主要傳遞由具有顯著炎癥指標的炎性損傷引起的機械性痛覺超敏信號，PKCγ神經元傳遞由神經損傷而非炎性損傷誘導的機械性痛覺超敏信號，且PKCγ激酶本身也參與該信號的傳遞，脊髓背角深層的CCK神經元在傳遞炎性損傷及神經損傷誘導的機械性痛覺超敏信號中發揮重要作用。研究還證明，位于III-IV層的Maf 陽性CCK神經元由tVGLUT3神經元組成，主要傳遞動態機械性痛覺超敏信號。

本研究證實了PKCγ神經元在神經損傷誘導的機械性痛覺超敏反應中的關鍵作用，該類神經元的突起向脊髓背角腹側方向延伸，提示來自抑制性IIi層神經元的感受信號能夠在脊髓背角深層神經元整合以傳遞痛覺超敏信號。這一門控機制是否存在于炎性損傷誘導的痛覺超敏反應中還需進一步研究。本研究數據表明，脊髓背角深層神經元對炎性損傷痛覺超敏神經環路至關重要，這可能并不依賴于垂直細胞，因為CR神經元軸突同樣與I層的外周神經元連接。根據損傷性質研究機械性痛覺超敏神經環路是未來的主要研究方向，對理解機械性痛覺超敏的形成機制以及尋找有效的治療方法具有重要的意義。